BÀI 2: KỸ THUẬT PHA CHẾ MÔI TRƯỜNG

BÀI 2: KỸ THUẬT PHA CHẾ MÔI TRƯỜNG 1.VẤN ĐỀ LỰA CHỌN MÔI TRƯỜNG Khi khởi sự nuôi cấy mô và tế bào đối với một số đối tượng nhất định, vấn đề đặt ra là chọn môi trường nào và trên cơ sở nào để phối hợp tỷ lệ các chất dinh dưỡng. Cách thường làm là qua các tài liệu đã xuất bản, các công trình đã nghiên cứu về đối tượng đó hoặc cùng họ tương đương xem các tác giả đã sử dụng môi trường loại nào. ...
Nội dung trích xuất từ tài liệu:
BÀI 2: KỸ THUẬT PHA CHẾ MÔI TRƯỜNG BÀI 2:KỸ THUẬT PHA CHẾ MÔI TRƯỜNG1.VẤN ĐỀ LỰA CHỌN MÔI TRƯỜNGKhi khởi sự nuôi cấy mô và tế bào đối với một số đối tượng nhất đ ịnh, vấn đ ề đặt ra làchọn môi trường nào và trên cơ sở nào đ ể phối hợp tỷ lệ các chất dinh dưỡng. Cáchthường làm là qua các tài liệu đ ã xu ất bản, các công trình đ ã nghiên cứu về đối tượngđó ho ặc cùng họ tương đương xem các tác giả đã sử dụng môi trường loại nào. Bướcđầu có thể giữ nguyên môi trường của tác giả đó ho ặc trên cơ sở đó mà cải tiến chophù hợp qua các thí nghiệm thăm dò.Trong hàng trăm môi trường do rất nhiều tác giả đề nghị cho nhiều loại cây khácnhau, nhiều mục đích nuôi cấy khác nhau. Về cơ bản có thể chia ra làm 3 loại:- Môi trường nghèo chất dinh d ưỡng: đ iển hình là môi truờng White,Knop vàKnudson C …- Môi trường có hàm lượng chất dinh d ưỡng trung bình: điển hình làmôi trường B5của Gamborg …- Môi trường giàu dinh d ưỡng: điển hình là môi trường MS (Murashige-Skoog)…Vì vậy khi bắt đầu nghiên cứu nuôi cấy mô một số đối tượng mới, chưa có tài liệutrước thì nên thăm dò so sánh 3 lo ại môi trường trên xem đối tượng nghiên cứu phùhợp với loại môi trường nào nhất. Sau đó cần thử tìm tỉ lệ NO3/ NH4+ thích hợp. Cáctác giả phương Tây làm việc với cây trồng cạn thường không đ ưa NH4+ vào môitrường. Nhưng đối với những cây dinh d ưỡng NH4 + mạnh như cây lúa, việc thêm vàomôi trường nuôi cấy một tỉ lệ NH4 + thích hợp chắc chắn sẽ có lợi. Việc sử dụng mangtính kinh nghiệm chủ nghĩa đối với một số môi trường đã cản trở khá nhiều sự tiến bộcủa công tác ở một số phòng thí nghiệm nuôi cấy mô thực vật. Thuốc lá và carốt là 2loại cây kinh đ iển của nuôi cấy mô thực vật. Môi trường nuôi cấy 2 loại cây này đãđược xây dựng khá hoàn chỉnh. Tuy vậy, không thể dùng nguyên các môi trường đóđể nghiên cứu các cây hoà thảo hoặc các cây họ đ ậu mà không có sự cải tiến, sửa đổi.Điều này giải thích sự tiến bộ chậm chạp của nuôi cấy mô một số cây hoà thảo so vớicây 2 lá mầm.Hiện nay, môi trường MS được coi như là môi trường thích hợp với nhiều loại cây dogiàu và cân b ằng về mặt dinh dưỡng. Vì vậy, những người tập sự làm nuôi cấy môthường bắt đầu với môi trường này trước khi tìm được môi trường của riêng mình.2.CHUẨN BỊ MÔI TRƯỜNGĐể thuận tiện cho việc pha các môi trường nuôi cấy người ta không cân hoá chất mỗilần pha mà thường chuẩn bị trước d ưới dạng các dung dịch đậm đặc (còn gọi là cácstock), sau đó chỉ cần pha loãng khi sử dụng. Các stock này thường được bảo quản dàingày trong tủ lạnh thường hoặc tủ lạnh sâu.2.1 Thành phần môi trường dinh dưỡngNước cấtChất hữu cơ - Đường- Acid amin- Vitamin (B1, B6, H, PP…)- Các chất đ iều hòa sinhtrưởng thực vật (Auxin, Cytokinin,Gibberellin…)Chất vô cơĐa lượng N P K Ca Mg SVi l ư ợng Fe Zn B Co N Mn Cu Al Mo ICác hợp chất không biết rõ thành phầnNước dừa, nước khoai tây, nước chuối, casein,hydrolysalt, trypton, pepton…THÀNH PHẦN MUỐI KHOÁNG CƠ BẢN CỦA MÔI TRƯỜNG MS (Murashigevà Skoog, 1962)SKOOG I SKOOG II SKOOG IIINH4NO3 :1650 mg/L FeSO4.7H2O : 27,8 mg/L KI : 0,83 mg/LKNO3 : 1900 mg/L MnSO4.4H2O : 22,3 mg/L Na2MoO4.2H2O :0,25 mg/LKH2PO4 : 170 mg/L H3BO3 : 6,2 mg/L CuSO4.5H2O : 0,025mg/LMgSO4.7H2O : 370 mg/L ZnSO4.7H2O : 8 ,6 mg/L CoCl2.6H2O : 0,025mg/LCaCl2.2H2 : 440 mg/LNa2EDTA : 37,3 mg/LTHÀNHPHẦN VITAMIN CỦA MOREL (Morel’sVitamin)Pirydoxine (B6) : 1 mg/LBiotin (H) : 0,01 mg/LMeso -inosito : 100 mg/LNicotinic acid (P.P) : 1 mg/LThiamin –HCl (B1) : 1 mg/LPantotate Calci :1 mg/L2.2 Cách pha các dung dịch mẹ (stock)* Stock đa lượng MS : SKOOG I (x10)(Pha thành 1Lvới nồng đ ộ sử dụng khi pha 1Lmôi trường MS là 100mL/L)NH4NO3 : 16500 mgKNO3 : 19000 mgKH2PO4 : 1700 mgMgSO4.7H2O : 3700 mgCaCl2.2H2O : 4400 mgCân và dùng nước cất hoà tan lần lượt từng chất trong bécher cho tan hoàn toàn. Dùngống đong 1L điều chỉnh cho đủ 1 lít.* Stock sắt MS: SKOOG II (x100)(Pha thành 200mL với nồng đ ộ sử dụng khi pha 1L mội trường MS là 2mL/L)Na2EDTA : 3730 mgFeSO4.7H2O : 2780 mgCân và hoà tan từng chất bằng 100mL nước cất trong mỗi bécher riêng.Đặt 2 bécher dung dịch lên bếp và gia nhiệt cho dung dịch ấm lên vừa có hơi nóngbốc lên là đ ược. Khuấy đều và đổ dung dịch Na2EDTA vào ống đong 200 mL, rồicho từ từ dung dịch FeSO4vào, vừa cho vừa khuấy đều. Để nguộI rồi cho vào bình tốibảo quản trong tủ lạnh.* Stock vi lượng MS: SKOOG III (x100)Trước tiên cần chuẩn bị các stock con:Dung d ịch KI: (83mg/mL)Cân 8300 mg KI hoà tan với nước cất cho đủ 100mLDung d ịch Na2MoO4.2H2O: (25mg/mL)Cân 2500mg Na2MoO4.2H2O hoà tan với nước cất cho đủ 100mLDung d ịch CuSO4.5H2O (2,5mg/mL)Cân 250mg CuSO4.5H2O hòa tan với nước cất cho đủ 100mLDung d ịch CoCl2.6H2O (2,5 mg/mL)Cân 250 mg CoCl2.5H2O hòa tan với nước cất cho đủ 100 mLSKOOG III (x100) : pha thành 500mL với nồng độ sử dụng khi pha 1L môi trườngMS là 5mL/L ...