BÁO CÁO ỨNG DỤNG QUI TRÌNH PCR THỜI GIAN THẬT PHÁT HIỆN VI KHUẨN Aeromonas hydrophila NHIỄM TRÊN CÁ TRA (Pangasianodon hypophthalmus)

Qui trình realtime-PCR sử dụng Syber green phát hiện vi khuẩn Aeromonas hydrophila gây bệnh xuất huyết trên cá tra (Pangasianodon hypophthalmus) được thực hiện và chuẩn hóa. Cặp mồi AeroFd và AeroRs được sử dụng để khuếch đại đoạn gen aerolysin đặc hiệu của vi khuẩn A. hydrophila với sản phẩm PCR là 209 bp (Panagala et al., 2007). Qui trình được thực hiện có khả năng phát hiện DNA vi khuẩn với hàm lượng thấp nhất là 100 pg. Tính đặc hiệu của qui trình được kiểm tra với các loài vi khuẩn phổ biến trong thuỷ...
Nội dung trích xuất từ tài liệu:
BÁO CÁO " ỨNG DỤNG QUI TRÌNH PCR THỜI GIAN THẬT PHÁT HIỆN VI KHUẨN Aeromonas hydrophila NHIỄM TRÊN CÁ TRA (Pangasianodon hypophthalmus) " Kỷ yếu Hội nghị khoa học thủy sản lần 4: 270-277 Trường Đại học Cần Thơ ỨNG DỤNG QUI TRÌNH PCR THỜI GIAN THẬT PHÁT HIỆN VI KHUẨN Aeromonas hydrophila NHIỄM TRÊN CÁ TRA (Pangasianodon hypophthalmus) Đặng Thị Hoàng Oanh1 và Đỗ Xuân Hoa1 ABSTRACT A Syber green realtime-PCR protocol to detect Aeromonas hydrophila bacteria which causes haemorhagic disease in striped catfish (Pangasianodon hypophthalmus) was set up and optimized. Forward and reverse primers from Panagala et al. (2007) were used to amplified a 209 bp unique sequence of aerolysin gene of A. hydrophila. The optimized protocol can detect DNA from A. hydrophila as low as 100 pg. The specificity of the protocol were tested with other common bacteria in aquaculture including Vibrio harveyi, V. anguillarum, V. alginolyticus, Aeromonas carviae, Edwardsiella ictaluri, Pseudomonas putida, Escherichia coli and Bacillus subtilis. The result showed that optimized realtime PCR protocol can be applied for specific, rapid and sensitive detection of A. hydrophila infection in striped catfish in seed selection and effective prevention and treatment of bacterial disease in catfish. Keywords: Striped catfish, Aeromonas hydrophila, realtime PCR. Title: Study on the application of realtime PCR protocol to detect Aeromonas hydrophila bacterial infection on the striped catfish (Pangasianodon hypophthalmus) TÓM TẮT Qui trình realtime-PCR sử dụng Syber green phát hiện vi khuẩn Aeromonas hydrophila gây bệnh xuất huyết trên cá tra (Pangasianodon hypophthalmus) được thực hiện và chuẩn hóa. Cặp mồi AeroFd và AeroRs được sử dụng để khuếch đại đoạn gen aerolysin đặc hiệu của vi khuẩn A. hydrophila với sản phẩm PCR là 209 bp (Panagala et al., 2007). Qui trình được thực hiện có khả năng phát hiện DNA vi khuẩn với hàm lượng thấp nhất là 100 pg. Tính đặc hiệu của qui trình được kiểm tra với các loài vi khuẩn phổ biến trong thuỷ sản là Vibrio harveyi, V. anguillarum, V. alginolyticus, Edwardsiella ictaluri, Aeromonas carviae, Pseudomonas putida, Escherichia coli và Bacillus subtilis. Kết quả cho thấy có thể sử dụng qui trình để phát hiện nhanh, nhạy và đặc hiệu 1 Khoa Thủy sản, Đại học Cần Thơ 270 Kỷ yếu Hội nghị khoa học thủy sản lần 4: 270-277 Trường Đại học Cần Thơ vi khuẩn A. hydrophila nhiễm trên cá tra nhằm làm cơ sở cho việc chọn giống cũng như đề xuất giải pháp hiệu quả trong phòng và trị bệnh xuất huyết ở cá tra. Từ khóa: Cá tra, Aeromonas hydrophila, realtime PCR. 1 GIỚI THIỆU Nghề nuôi cá tra ở Đồng bằng sông Cửu Long (ĐBSCL) đang phát triển rất mạnh và tự phát vượt ngoài tầm kiểm soát của các nhà quản lý, dẫn đến các vấn đề về ô nhiễm môi trường và dịch bệnh ngày càng nhiều. Trong đó, vi khuẩn là một trong những tác nhân gây bệnh nghiêm trọng, là trở lực kìm hãm sự phát triển và mở rộng sản xuất trong nuôi trồng thủy sản. Bệnh xuất huyết do vi khuẩn Aeromonas hydrophila là một trong những bệnh phổ biến và xuất hiện hầu như quanh năm ở ao nuôi cá tra (Lý Thị Thanh Loan, 2009). Có nhiều phương pháp để phát hiện vi khuẩn A. hydrophila nhiễm trên cá tra. Các phương pháp được sử dụng phổ biến hiện nay là phương pháp xác định đặc tính sinh lý, sinh hóa truyền thống hoặc sử dụng bộ kít API 20E. Phương pháp PCR cũng được ứng dụng để phát hiện vi khuẩn A. hydrophila trực tiếp từ mô thận cá tra (Nguyễn Hà Giang và Đặng Thị Hoàng Oanh, 2010). Tuy nhiên thời gian phát hiện mầm bệnh của các phương pháp vẫn này còn dài và định tính. Việc ứng dụng một phương pháp xác định nhanh, chính xác hơn và định lượng mầm bệnh vi khuẩn A. hydrophila ở cá tra là nhu cầu cấp thiết trong việc quản lý dịch bệnh xuất huyết ở cá tra. Trong nghiên cứu này kỹ thuật PCR thời gian thật (realtime-PCR/qPCR) chẩn đoán bệnh xuất huyết do vi khuẩn A. hydrophila gây ra trên cá tra được thực hiện, chuẩn hóa và ứng dụng nhằm rút ngắn thời gian phát hiện cũng như xác định mức độ nhiễm vi khuẩn A. hydrophila trên cá tra, góp phần vào việc chọn giống, phòng ngừa và quản lý bệnh này. 2 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1 Vật liệu nghiên cứu Chủng vi khuẩn được chọn để nghiên cứu là A. hydrophila CA.1.2T thuộc bộ sưu tập vi khuẩn, Khoa Thủy sản. Chủng vi khuẩn này được phân lập từ cá tra có dấu hiệu bệnh xuất huyết, vi khuẩn được nuôi trong môi trường nutrient broth (NB) có bổ sung 25% glycerol và giữ ở -80°C. Vi khuẩn được phục hồi trên môi trường Trypton soya agar (TSA) và ủ ở 28°C trong vòng 24 giờ. Sau đó chọn một khuẩn lạc rời từ đĩa cấy thuần cấy lên môi trường aeromonas agar, ủ ở 28°C trong vòng 24 giờ, sau đó nuôi tăng sinh vi khuẩn trong môi trường NB. Vi khuẩn được kiểm tra bằng phương pháp PCR (Nguyễn Hà Giang và Đặng Thị Hoàng Oanh, 2010) để được xác định là A. hydrophila trước khi sử dụng để thực hiện và chuẩn hóa qui trình qPCR. 271 Kỷ yếu Hội nghị khoa học thủy sản lần 4: 270-277 Trường Đại học Cần Thơ 2.2 Chiết tách DNA vi khuẩn Vi khuẩn được nuôi tăng sinh (48 giờ) trong ống nghiệm có chứa 5 ml môi trường NB ở nhiệt độ 28ºC và được chiết tách theo phương pháp của Bartie và ctv (2006). 1,5 ml dung dịch vi khuẩn được cho vào ống ly tâm cùng với 100 µl TE (10 mM Tris-HCL, 1 mM EDTA, pH 8,0). Hỗn hợp được đun nóng ở 95ºC trong 15 phút, rồi được làm lạnh trong nước đá và ly tâm 2 phút ở vận tốc 14.000 vòng/phút để tách dung dịch DNA và trữ ở -20 ºC cho đến khi sử dụng. 2.3 Phản ứng Realtime PCR Mồi xuôi và mồi ngược được sử dụng để chuẩn hóa qui trình qPCR là AeroFd và Aero Rv (Pannagala et al., 2007) được sử dụng để khuếch đại đoạn gen aerolysin đặc hiệu của vi khuẩn A. hydrophila với sản phẩm PCR là 209 bp. Thành phần hóa chất thực hiện phản ứng re ...