BÁO CÁO XÁC ĐỊNH QUY TRÌNH REAL TIME RT-PCR VỚI CHẤT NHUỘM EVAGREEN ĐỊNH LƯỢNG VÀ ĐỊNH CHỦNG VIRUT GÂY HỘI CHỨNG RỐI LOẠN SINH SẢN VÀ HÔ HẤP TRÊN HEO

Hội chứng rối loạn sinh sản hô hấp trên heo (PRRS, bệnh tai xanh) do virut (PRRSV) gây nhiều thiệt hại kinh tế. PRRSV gồm 2 dòng, châu Âu (EU) và Bắc Mỹ (NA), trong đó có chủng Trung Quốc - một biến chủng từ dòng Bắc Mỹ. Trong nghiên cứu này, quy trình real time RT-PCR sử dụng chất phát huỳnh quang EvaGreen với cặp mồi F7 và R7 được thiết kế trên vùng ORF7 cho phép phân biệt dòng NA/EU và định lượng PRRSV. Toàn bộ vùng ORF7 của bộ gen PRRSV được gắn vào plasmid pGEM T...
Nội dung trích xuất từ tài liệu:
BÁO CÁO " XÁC ĐỊNH QUY TRÌNH REAL TIME RT-PCR VỚI CHẤT NHUỘM EVAGREEN ĐỊNH LƯỢNG VÀ ĐỊNH CHỦNG VIRUT GÂY HỘI CHỨNG RỐI LOẠN SINH SẢN VÀ HÔ HẤP TRÊN HEO " XÁC ĐỊNH QUY TRÌNH REAL TIME RT-PCR VỚI CHẤT NHUỘM EVAGREEN ĐỊ NH LƢƠNG VA ĐỊ NH CHUNG VIRUT GÂY HỘI CHỨNG RÔI LOAN SINH SAN VA HÔ HÂP ̣ ̀ ̉ ́ ̣ ̉ ̀ ́ TRÊN HEO Võ Khánh Hưng(1), Nguyễn Văn Chí(1), Lê Nguyễn Ngọc Hạnh(2), Trần Thị Dân (3), Trần Thị Bích Liên(3), Nguyễn Đình Quát(3) TÓM TẮT Hội chứng rối loạn sinh sản hô hấp trên heo (PRRS, bệnh tai xanh) do virut (PRRSV) gây nhiềuthiệt hại kinh tế. PRRSV gồm 2 dòng, châu Âu (EU) và Bắc Mỹ (NA), trong đó có chủng Trung Quốc- một biến chủng từ dòng Bắc Mỹ. Trong nghiên cứu này, quy trình real time RT-PCR sử dụng chấtphát huỳnh quang EvaGreen với cặp mồi F7 và R7 được thiết kế trên vùng ORF7 cho phép phân biệtdòng NA/EU và định lượng PRRSV. Toàn bộ vùng ORF7 của bộ gen PRRSV được gắn vào plasmidpGEM T Easy và chuyển vào tế bào chủ E. coli DH5α để có mẫu DNA dùng trong tạo đường chuẩnđịnh lượng của quy trình. Độ nhạy của quy trình real time RT-PCR được xác định là 101 bản sao/μl.Tính đặc hiệu của phản ứng được khẳng định với porcine circovirus (PCV) và mẫu máu âm tính vớiPRRSV. Quy trình có thể định dòng PRRSV châu Âu và dòng Bắc Mỹ dựa vào sự chênh lệch vềnhiệt độ nóng chảy (Tm) khi phân tích đường cong nhiệt độ nóng chảy. Nhiệt độ Tm của sản phẩmkhuếch đại dòng châu Âu là 83,4oC và dòng Bắc Mỹ là 84,4oC (CV = 0,08%, P < 0,01). Quy trình realtime RT-PCR sử dụng EvaGreen cho kết quả nhanh, nhạy và chính xác trong định dòng và định lượngPRRSV; đã được áp dụng để phân biệt dòng cũng như định lượng PRRSV trên một số mẫu máu vàmẫu ngoáy hầu họng heo từ một trại chăn nuôi công nghiệp. Từ khóa: PRRSV, real time RT-PCR, Định chủng, Phân tích nhiệt độ nóng chảy, EvaGreen. QUATIFING AND GENOTYPING OF PORCINE REPRODUCTIVE AND RESPIRATORY SYNDROME VIRUS BY REAL-TIME RT-PCR USING EVAGREEN Võ Khánh Hưng, Nguyễn Văn Chí, Lê Nguyễn Ngọc Hạnh, Trần Thị Dân , Trần Thị Bích Liên, Nguyễn Đình Quát SUMMARY Porcine reproductive and respiratory syndrome (PRRS) caused by PRRSV is detrimental toeconomy. There are two types of PRRSV, being North American (NA) type and Europe (EU) type.EvaGreen-based real time RT-PCR protocol was established for quantifying and genotyping PRRSvirus, in which F7 and R7 primers were designed on ORF7 of the virus. A standard curve used in theassay was created by a plasmid DNA template. The whole ORF7 of PRRSV genome was inserted intopGEM T Easy plasmid, then, cloned into E.coli DH5α. The sensibility of the assay was 101 copies/ul.The specificity of the assay was confirmed by using PCV (porcine circovirus) and PRRSV-free bloodof pig. Genotyping of EU PRRSV and US PRRSV was based on the difference of melt temperature(Tm) in melt curve analysis. The Tm of EU PRRSV amplicon was 83.4oC and that of US PRRSVamplicon was 84.4oC. The results showed that EvaGreen-based real time RT-PCR assay could offerquick, sensitive and accurate results for quantifying and genotyping PRRSV, which was used todetermined genotypes and viral load of blood samples and swab from post weaning pigs. Key words: PRRSV, Real time RT-PCR, Genotyping, Melting curve analysis,EvaGreen(1) Bộ môn Công nghệ sinh học, Đại học Nông Lâm TP.HCM(2) Sở NN và PTNT Đồng Nai(3) Khoa chăn nuôi thú y, Đại học Nông Lâm TP.HCM 42 1. ĐẶT VẤN ĐỀ Hội chứng rôi loan sinh san va hô hấp (PRRS) là bệnh xảy ra trên heo với đặc điểm gây sẩy thai ở ́ ̣ ̉ ̀heo nái và rối loan hô h ấp trên heo sơ sinh và heo choai (Christianson va cs, 1992). PRRS do 2 dòng ̣ ̀virut gây bệnh ở Việt Nam : dòng Bắc Mỹ và dòng Châu Âu (Trần Thị Bích Liên và Trần Thị Dân,2007). Đó là virut dạng sợi đơn, thẳng, vỏ bao. Hạt PRRSV có dạng hình cầu với đường kính khoảng45 đến 65 nm đối với dòng châu Âu (Wensvoort và cs., 1991) và từ 48 đến 83 nm ở dòng Bắc Mỹ(Benfield và cs., 2006; Dea và cs, 2000). Bô gen cua virut PRRS chưa 9 khung đoc mơ (ORF). ORF1a ̣ ̉ ́ ̣ ̉và ORF1b ghi ma glycoprotein không cấu trúc, trong khi ORF 2a, ORF2b va ORF 3 – 7 lân lươt ma ̃ ̀ ̀ ̣ ̃hóa protein câu truc GP 2, E, GP3, GP4, GP5, protein màng và protein của nucleocapsid. Protein c ...