Công nghệ sinh học phân tử

Các bước cơ bản tạo ADN tái tổ hợp: • Tách chiết phân tách AND ngoại lai từ sinh vật đích • Phản ứng nối AND – vector tạo phân tử AND TTH • Chuyển AND TTH vào tế bào chủ • Chọn lọc các tế bào mang AND TTH • Sản xuất, tinh sạch protein
Nội dung trích xuất từ tài liệu:
Công nghệ sinh học phân tửCÔNGNGHỆSINHHỌCPHÂNTỬ CÔNGNGHỆADNTÁITỔHỢP CácbướccơbảntạoADNtáitổhợp TáchchiếtphântáchANDngoạilaitừsinhvậtđích• PhảnứngnốiAND–vectortạophântửANDTTH• ChuyểnANDTTHvàotếbàochủ• ChọnlọccáctếbàomangANDTTH• Sảnxuất,tinhsạchprotein• CÔNGNGHỆADNTÁITỔHỢP• Endonucleasegiớihạn(RE)CÔNGNGHỆADNTÁITỔHỢP Vectornhândòng 1.Vectorplasmid•Vectorplasmid•Vectorthựckhuẩnthểlambda•Cosmid•BAC•YAC Thaotácbiểuhiệnởsinhvậtnhânsơ Biểuhiệngenởcácpromotermạnhvàcóthểđiều chỉnho Promotermạnh CóáilựccaovớiARN–polvùngnằmngaysaunóđượcphiênmã• thườngxuyên Tốiưuhóasựbiểuhiệncủagennhândòng• Khókhăn:• Kiệtquệnănglượngcủatếbàochủsuyyếucácchứcnăngcầnthiếto Promotercóthểđiềuchỉnh Chỉbiểuhiệngennhândòngtronggiaiđoạnsinhtrưởngđặcbiệtcủatế• bàochủ Chỉbiểuhiệntrongmộtthờigianxácđịnh• ThaotácbiểuhiệnởsinhvậtnhânsơMộtsốpromoterphổbiến Promoterlaco Promotertrpo Promotertaco Promotertrco PromoterpLo Promotergen10từthựckhuẩnthểT7o Thaotácbiểuhiệnởsinhvậtnhânsơo Promoter lac Nồng Nồng Nồng Mức độ Vùng promoter – operator lac độ độ độ phiên glucos lactos AMPv mã e e AMPv Thể ức CA chế lac Thấp Thấp Thấp cao P operator gen promoter Thể ức Thấp Thấp Thấp cao chế lac operator gen promoter Thấp Thấp cao cao promoter operator gen AMPv CA Thấp cao cao cao P promoter operator gen Thaotácbiểuhiệnởsinhvậtnhânsơo Promotertrp• Điềuhòaâm:nồngđộtrptăngđóngpromoterứcchế phiênmã• Hiệntượng“ròrỉ”:phiênmãvẫndiễnrangaycảkhigen đãđónglại Thaotácbiểuhiệnởsinhvậtnhânsơo Promotertacvàtrc:• Chứavùng35củapromotertrpvàvùng10củapromoterlac• khácnhaumộtcặpbaseduynhất: Promotertac:vùng35củatrpvà10củalaccáchnhau16base Promotertrc:vùng35củatrpvà10củalaccáchnhau17base• ĐềuđượccảmứngkhibổsungIPTGvàomôitrường• Mạnhhơnpromotertrp3lần,hơnpromoterlac10lần Thaotácbiểuhiệnởsinhvậtnhânsơo PromoterPl• ĐượckiểmsoátbởiproteinứcchếcIcủathựckhuẩn thểlambda• Đượckiểmsoátnhờsựnhạynhiệtđộ: ở30oC,thểứcchếcIđượctổnghợpliêntụcliênkếtvới operatorcủapromoterPlngăncảndịchmãtổnghợpprotein đích ở42oC,thểứcchếbịbấthoạtpromoterhoạtđộngprotein đích Thaotácbiểuhiệnởsinhvậtnhânsơo Promotergen10củathựckhuẩnthểT7• GenT7ARN–pol–kiểmsoátphiênmãcủagenđíchđược chènvàoNSTcủaE.colitrênmộtthểtiềmtancủathựckhuẩn thểlambdadướisựkiểmsoátcủapromoterlaccủaE.coli• KhikhôngcólactosehoặcIPTG,thểứcchếlacđượctổnghợp, ứcchếo–lacvàp–lacứcchếtổnghợpT7ARN–pol genđíchkhôngđượcphiênmã• KhicólactosehoặcIPTGliênkếtvớithểứcchếlacngăn cảnsựứcchếphiênmãT7ARN–polgenđíchđượcphiên mã PROTEINDUNGHỢP Proteindunghợp=proteinđíchliênkếtproteintếbàochủ bảovệproteinđíchkhỏisựphânhủycủaproteasetếbàochủ Gắnnốiphầnmãhóacủahaihaynhiềugenvớinhau Sựcómặtcủaproteinchủproteindunghợpkhôngthích hợpchoứngdụnglâmsàng Proteinchủcóthểảnhhưởngđếnhoạttínhsinhhọccủa proteinđích Cắtproteindunghợp:• Nốigenproteinđíchvàproteinchủbằngmộtđoạn oligonucleitidemãhóachocácaađượcnhậnbiếtbởiprotease khôngphảicủavikhuẩn PROTEINDUNGHỢP Proteindunghợpvàvấnđềcuộnứngdụngcủaproteindunghợp gậpproteino Sửdụnglàmkhángnguyên, Mộtsốproteinkhôngtanthểvùi • khôngcóhoạttínhsinhhọc khángthể • Khắcphục:tạoproteindunghợpo Đượcdùngđểđơngiảnhóa • Proteindunghợpproteinđích– quáquátrìnhtinhsạch thioredoxin–đượctổnghợpvàtích protein tụởvùngnhạythẩmthấu  tiếtvàomôitrườngnuôicấydạng hòatan tinhsạchbằngủởnhiệtđộcao– nhờtínhbềnnhiệt(80oCcủa thioredoxin) Xếpliêntiếpcácgentheomộthướng VẤNĐỀ:o Đểtănglượngproteingennhândòng tăng CC TA TC sốbảnsaoplasmid G A A Cạnkiệtnguồnnănglượngtếbào CC AT AG C T ...