GIẢI TRÌNH TỰ GEN

Có 2 phương pháp chính- Phương pháp hóa học Maxam – Gilbert: đây là phương pháp được sử dụng đầu tiên để xác định trình tự gen nhưng hiện nay không còn được sử dụng phổ biến nữa- Phương pháp Enzyme SangerNguyên lý- Sử dụng các chất hóa học cắt đứt sợi DNA lại 1 loại nucleotide đặc hiệu
Nội dung trích xuất từ tài liệu:
GIẢI TRÌNH TỰ GENGIẢI TRÌNH TỰ GENC¸c ph¬ng ph¸p g i¶i tr×nh tù g e n Cã 2 ph¬ng ph¸p chÝnh: – Ph¬ng ph¸p ho¸ häc Maxam – Gilbert: ®©y lµ ph ¬ng ph¸p ®îc sö dông ®Çu tiªn ®Ó x¸c ®Þnh tr×nh tù gen nhng hiÖn nay kh«ng cßn ®ù¬c sö dông phæ biÕn n÷a. – Ph¬ng ph¸p Enzyme Sanger1. Ph¬ng ph¸p ho ¸ häc Maxam Gilbe rt Walter GilbertNguyªn lý Sö dông c¸c chÊt ho¸ häc c¾t ®øt sîi DNA t¹i 1 lo¹i nucleotide ®Æc hiÖu Ph©n tö DNA kÐp ®îc ®¸nh dÊu P 32 t¹i ®Çu 5’ T¸ch rêi 2 sîi ®¬n b»ng nhiÖt Xö lý ho¸ häc sao cho chØ cã 1 lo¹i nucleotide bÞ ph¸ huû ->hµng lo¹t ®o¹n DNA cã kÝch thíc kh¸c nhau ®îc t¹o thµnh (sö dông c¸c chÊt ho¸ häc kh¸c nhau ph¸ huû 4 lo¹i nucleotide b»ng 4 ph¶n øng riªng biÖt) TiÕn hµnh ®iÖn di c¸c ®o¹n DNA thu ®ù¬c trªn gel polyacrylamide, chØ quan s¸t ®ù¬c ®o¹n cã g¾n P 32. §o¹n DNA ng¾n nhÊt cã ®¸nh dÊu phãng x¹ sÏ ch¹y nhanh nhÊt díi t¸c dông cña ®iÖn trêng. C¨n cø vµo vÞ trÝ c¸c v¹ch quan s¸t ®îc trªn gel mµ x¸c ®Þnh tr×nh tù c¸c nucleotide. MAXAM-GILBERT CHEMICALLabeled strand (P32) SEQUENCING ddNTP Reaction Mix 5’- Treat with4 tubes chemicals that specifically C T A G cleave at a G-rxn A>G T>C certain base. 3’ -rxn C-rxn -rxn G C A 5’- T C T C C 5’- A C T A G 5’- G C 5’ autoradiograph of The reaction is done such that each dried sequencing gel strand is cleaved only once Sequence is read directlyPh¸ huû c¸c nucleotideTrong ph¬ng ph¸p nµy sö dông 5 ph¶n øng c¬b¶n: Dimethylsulfate ë pH 8.0 sÏ lµm thay ®æi Guanine (G). Piperidine formate ë pH 2.0 sÏ ph¸ vì cÇu nèi glycoside gi÷a deoxyribose víi purine (G,A) Hydrazine: më c¸c vßng pyrimidine (C , T) Hydrazine khi cã mÆt1.5M NaCl chØ cã t¸c dông ®èi víi C 1.2N NaOH ë 900C sÏ ph¸ huû A m¹nh vµ C kÐm.KÕt qu¶:Dimethylsulfate at pH 8.0 -----------> GPiperidine formate at pH 2.0 -------> G and AHydrazine ------------------------------> C and THydrazine in 1.5 M NaCl -----------> C1.2 N NaOH at 90 oC -----------------> A and C 3’ X X Dimethyl Piperidine Hydrazine Hydrazine in 1.2 N sulfate pH formate 1.5 M NaCl NaOH at to 8 pH 2 C 90 oC G G+A T+C X A>C X X 5’ GACGTACTTA3’ 5’ XG G+A T+C C A>CNhîc ®iÓm Ho¸ chÊt ®éc CÇn mét lîng lín chÊt phãng x¹ ThiÕu sù tù ®éng §«i khi kÕt qu¶ thu ®ù¬c trªn gel kh«ng chÝnh x¸c2. Ph¬ng ph¸p enzyme Sanger Fred SangerNguyªn lý Sö dông dideoxynucleotide kh«ng cã nhãm OH ë vÞ trÝ 3’ trong ph¶n øng tæng hîp DNA =>ph¬ng ph¸p dideoxy Ph©n tö DNA kÐp ®îc ®¸nh dÊu P 32 t¹i ®Çu 5 ’ Sîi ®«i DNA bÞ biÕn tÝnh thµnh hai sîi ®¬n vµ ®ù¬c lai víi måi (dµi vµi chôc nu, liÖn kÕt ®ù¬c víi 1 trong 2 m¹ch ®¬n) TiÕn hµnh ®ång thêi 4 ph¶n øng riªng lÏvíi 4 lo¹i dideoxynucleotide kh¸c nhau -> c¸c sîi ®¬n DNA ®îc tæng hîp cã ®é dµi ng¾n kh¸c nhau DiÖn di 4 s¶n phÈm cïng lóc trªn gel polyacrylamide §äc kÕt qu¶. Dideoxy-Nucleotides Base Base(P)-(P)-(P)- O (P)-(P)-(P)- O OH H H H dNTP ddNTP If a ddNTP is added to a growing DNA chain, the sequence is terminated, because another base can not be added SANGER DIDEOXY SEQUENCING èng èng èng èng ddNTP Reaction Mix ph¶n ph¶n ph¶n ph¶n øng A øng C øng G øng T dATP dATP dATP dATP dCTP C T A G dCTP dCTP dCTP dGTP dGTP dGTP dGTP dTTP dTTP dTTP dTTP ddATP ddCTP ddGTP ddTTP §o¹n ADN cÇn gi¶i tr×nh tùMåi Sequencing 3’ ……….CCTATGGAATGC- 5’ * * èng ph¶n øng A *èng ph¶n øng ...