Hộp Điện Trong Công Nghệ DNA part 12

Tham khảo tài liệu hộp điện trong công nghệ dna part 12, kỹ thuật - công nghệ, điện - điện tử phục vụ nhu cầu học tập, nghiên cứu và làm việc hiệu quả
Nội dung trích xuất từ tài liệu:
Hộp Điện Trong Công Nghệ DNA part 123.2. Đặt mẫu DNA vào giếng Tùy thuộc vào từng mục đích điện di khác nhau có thể sử dụng nồng độ DNAcao hoặc thấp. Chẳng hạn theo tỷ lệ sau: DNA (1 g/1 L) 1 L Đệm màu bromophenol 1 L (×10 loading dye) Nước cất 2 lần 9 L Tổng số 11 L Dùng micropipette hút 11 L dung dịch trên cho vào giếng. Lưu ý mẫu chạyđiện di phải có dung tích thể tích của giếng. Thường đặt mẫu sau khi đã đổ dịch đệm 0,5× TAE vào buồng điện di chongập gel, ít khi đặt mẫu trước rồi đổ đệm sau (nạp khô). Để dễ làm việc nên dùngmicropipette loại 20-200 L và đặt buồng điện di trên bàn có nền đen. Khi tăngđiện áp của quá trình điện di, các đoạn DNA lớn thường dịch chuyển nhanh hơn sovới các đoạn nhỏ. Tuy nhiên, để có độ phân giải (resolution) tốt nhất đối với cácđoạn DNA có kích thước lớn hơn 2 kb thì điện áp được sử dụng phải nhỏ hơn 5V/cm (giá trị cm được tính theo khoảng cách giữa hai điện cực chứ không phải làchiều dài của gel). DNA dịch chuyển từ cực âm đến cực dương. Quan sát sự dịchchuyển bằng màu bromophenol để biết lúc nào cần ngừng điện di (Hình 2.5).3.3. Nhuộm DNA bằng EtBr Sau khi chạy điện di xong lấy nhẹ bản gel ra khỏi khuôn và ngâm vào dungdịch EtBr nồng độ 0,5 g/mL, trong thời gian 30-45 phút, tốt nhất trên một máy lắcnhẹ (độ 10 vòng/phút ). Đổ dịch nhuộm EtBr vào một bình riêng để xử lý và rửa bảngel bằng cách ngâm trong nước cất hai lần, mỗi lần 15-20 phút. EtBr thường pha sẵnở dạng đậm đặc 5 mg/mL và giữ ở 4oC trong tối. Hình 2.5. Sơ đồ minh họa các bước trong quá trình điện di agarose gel3.4. Quan sát và chụp ảnh Bản gel sau khi nhuộm EtBr được quan sát dưới ánh sáng tử ngoại ( = 302nm) (Hình 2.6). Dùng thiết bị chuyên dụng để phân tích và lưu trữ hình ảnh DNA(Gel Documentation System). Chú ý Không nhìn vào ánh sáng tử ngoại nếu không có kính lọc thích hợp.Hình 2.6. Hình ảnh điện di DNA chạy trên agarose gel 1%, 3 Volts/cm vànhuộm bằng EtBr. Các băng DNA có màu sáng. SM: Chuẩn kích thước của DNA(1 kb ladder). Các đường 1, 2 và 3: mẫu plasmid DNA được cắt bằng 3 enzymehạn chế khác nhau.III. Điện di polyacrylamide gel Acrylamide là một monomer có cấu trúc như sau: Khi có mặt các gốc tự do, được cung cấp bởi ammonium persulphate và ổnđịnh bởi TEMED (N,N,N’,N’-tetramethylethylene-diamine), phản ứng chuỗiđược bắt đầu trong đó các acrylamide monomer được polymer hóa (trùng hợp)thành một chuỗi dài. Khi bisacrylamide (N,N’-methylenebisacrylamide) được bổsung trong phản ứng polymer hóa, các chuỗi sẽ liên kết chéo (cross-linking) đểtạo thành dạng gel. Độ xốp của gel được xác định bởi chiều dài của chuỗi vàmức độ liên kết chéo. Chiều dài của chuỗi polyacrylamide được xác định bằngnồng độ acrylamide trong phản ứng polymer hóa (giữa 3,5% và 20%). Ngoài protein, polyacrylamide gel cũng được dùng để điện di DNA (kể cảRNA và DNA/RNA). Gel phải được rót vào giữa hai tấm kính (gel plates) đượcngăn cách bởi các miếng đệm (gel spacers) (Hình 2.7). Hầu hết các dung dịchacrylamide được ngăn không tiếp xúc với không khí để hạn chế sự ức chế trùnghợp gây ra bởi oxygen. Gel có thể dài từ 10-100 cm tùy thuộc vào yêu cầu phântích và chúng thường được chạy trong phương thẳng đứng. Hình 2.7. Sơ đồ và hình ảnh của buồng điện di polyacrylamide gel Phạm vi kích thước phân tử và độ phân giải của quá trình phân tách tùy thuộcvào nồng độ của acrylamide và bis-acrylamide (và tỷ lệ của chúng) do chúng tạo rakhuôn gel với các phần trăm khác nhau của acrylamide và bậc của liên kết chéo.Nồng độ thấp tạo ra các lỗ có kích thước lớn hơn và vì thế có thể phân tách cácphân tử lớn hơn. Liên kết chéo của các monomer và các tác nhân liên kết có thểđược điều chỉnh để kiểm soát mức độ xốp của khuôn gel. Điều này cho phép tối ưuhóa một khuôn gel để phân tách một phạm vi kích thước đặc biệt của các phân tửprotein.1. Điện di nucleic acid Điện di polyacrylamide gel được dùng để phân tách và thu hồi các đoạnDNA có chiều dài từ 5-2.000 bp. Nồng độ polyacrylamide gel được sử dụngtrong khoảng từ 3,5-20% tùy thuộc vào kích thước của đoạn DNA quan tâm. Hailoại polyacrylamide gel thường được sử dụng là: - Polyacrylamide gel không biến tính dùng để phân tách và tinh sạch các đoạnDNA sợi đôi. - Polyacrylamide gel biến tính bằng urea và formamide (sequencing gel) dùngđể phân tách và tinh sạch các đoạn DNA sợi đơn. Phần này chỉ giới thiệu polyacrylamide gel không biến tính là loại gel hayđược sử dụng nhất. Hiệu quả của sự phân tách DNA trong loại gel này phụ thuộcvào nồng độ của acrylamide (Bảng 2.3), kích thước và điện tích của DNA. Bảng 2.3. Hiệu quả của sự phân tách DNA trong polyacrylamide gel không biến tính1.1. Chuẩn bị polyacrylamide gel không biến tính Kích thước phổ biến của tấm kính đổ gel thường là 20 cm 40 cm. Miếngđệm dày khoảng 0,5 mm-2,0 mm. Các gel dày hơn thường nóng lên trong quátrình điện di nên sẽ làm nhòe các băng DNA, vì thế người ta thường sử dụng cácgel mỏng. Tuy nhiên, khi khi chạy một lượng lớn DNA (>1 g/băng) thì cầnchuẩn bị gel dày. Dưới đây mô tả các bước chuẩn bị và sử dụng polyacrylamidegel không biến tính:1.1.1. Chuẩn bị các dung dịch sau: - 30% acrylamide (bao gồm bis-acrylamide) - 1× TBE - 10% ammonium persulphate1.1.2. Lau sạch hai tấm kính dùng làm khuôn gel và miếng đệm bằngKOH/methanol hoặc ethanol. Xử lý bề mặt của hai tấm kính bằng dung dịchsilicon để ngăn gel dính chặt vào hai tấm kính gây rách gel lúc lấy nó ra khỏikhuôn sau khi điện di xong.1.1.3. Tính toán thể tích của các dung dịch dùng để tạo polyacrylamide gel trên cơsở kích thước tấm kính, độ dày của miếng đệm (xem bảng 2.4). ...