Kỹ thuật hiển vi huỳnh quang

Kỹ thuật hiển vi huỳnh quang dùng để nghiên cứu các loại mẫu vật, ứng dụng quan trọng trong phương pháp huỳnh quang miễn dịch.
Nội dung trích xuất từ tài liệu:
Kỹ thuật hiển vi huỳnh quangKĩ thu t hi n vi huỳnh quang Khi các m u v t, s ng hay không s ng, h u cơ ho c vô cơ, h p th r i táiphát x ánh sáng, quá trình ư c g i là hi n tư ng phát sáng quang hóa. N u sphát x ánh sáng v n kéo dài t i vài giây sau khi năng lư ng (ánh sáng) kích thíchthôi tác d ng, thì hi n tư ng ư c g i là lân quang. Còn hi n tư ng huỳnh quangmô t s phát x ánh sáng ch ti p t c di n ra khi ang h p th ánh sáng kích thích.Kho ng th i gian gi a lúc h p th ánh sáng kích thích và lúc tái phát x ánh sángtrong hi n tư ng huỳnh quang là c c kì ng n, thư ng dư i m t ph n tri u giây. Hình 1. Quan sát c a Stoke Hi n tư ng huỳnh quang ư c bi t n vào gi a th k 19. Nhà khoa h cngư i Anh George G. Stoke l n u tiên quan sát th y khoáng v t fluorite bi u hi nhuỳnh quang khi ư c r i b ng ánh sáng t ngo i, và ông ã t ra t “huỳnhquang”. Stoke nh n th y ánh sáng huỳnh quang có bư c sóng dài hơn ánh sáng kíchthích, m t hi n tư ng tr nên n i ti ng dư i cái tên s l ch Stoke. Trong hình 1,m t photon b c x t ngo i (màu tím) va ch m v i m t electron trong m t nguyênt , kích thích và ưa electron lên m c năng lư ng cao hơn. Sau ó, electron kíchthích rơi xu ng m c th p hơn và phát ra ánh sáng dư i d ng m t photon năng lư ngth p hơn (màu ) trong vùng ánh sáng kh ki n. Hình 2 là bi u bi u di n vùngánh sáng kh ki n c a b c x i n t , v i bư c sóng tr i r ng t x p x 400 n 700nanomét. Bao quanh vùng kh ki n là ánh sáng t ngo i có năng lư ng cao hơn vàánh sáng h ng ngo i có năng lư ng th p hơn. Hình 2. Ph ánh sáng “tr ng” Hi n vi huỳnh quang là m t phương pháp tiên ti n nghiên c u v t ch t cóth làm cho phát huỳnh quang, ho c dư i d ng t nhiên (g i là s t phát huỳnhquang, ho c huỳnh quang sơ c p), ho c sau khi x lí v i các hóa ch t có kh nănghuỳnh quang (g i là huỳnh quang th c p). Hi n vi huỳnh quang là sáng ch vào u th k 19 c a August Kor, Carl Reichert, và Heinrich Lehmann, và nhi u ngư ikhác. Tuy nhiên, ti m năng c a thi t b này không ư c nh n ra trong nhi u th p k ,và kính hi n vi huỳnh quang hi n nay là m t công c quan tr ng (có l là không ththi u) trong ngành sinh h c t bào. Kĩ thu t hi n vi huỳnh quang | Trang 1/5 Nh ng nghiên c u ban u cho th y nhi u m u v t, g m các vi khoáng v t,tinh th , nh a thông, thu c thô, bơ, ch t di p l c, vitamin, và các h p ch t vô cơ,bi u hi n huỳnh quang t phát khi ư c chi u sáng b ng ánh sáng t ngo i. Tuynhiên, mãi cho n nh ng năm 1930 thì nhà nghiên c u ngư i Áo Max Haitinger vàcác nhà khoa h c khác m i phát tri n ư c kĩ thu t huỳnh quang th c p, s d ngph m màu fluorochrome nhu m các thành ph n mô c bi t, vi khu n, và nh ngm m b nh khác không th phát huỳnh quang t phát. Các ph m màu fluorochromenày, g n v i các m c tiêu hóa sinh c bi t, ã khích l vi c s d ng kính hi n vihuỳnh quang. Giá tr c a thi t b này ư c nâng cao áng k vào nh ng năm 1950khi Albert Coons và Nathan Kaplan ch ng minh ư c s nh v c a kháng nguyêntrong mô ph n ng v i kháng th g n fluorescein. Công vi c chính c a hi n vi huỳnh quang là cho phép ánh sáng kích thíchchi u sáng m u v t, và r i tách ánh sáng huỳnh quang phát x y u hơn nhi u ra kh iánh sáng kích thích m nh hơn. Như v y, ch có ánh sáng phát ra t m u v t i t im t ho c m t máy dò khác nào ó (thư ng là m t camera kĩ thu t s ho c cameraphim thông thư ng). Nh ng vùng huỳnh quang thu ư c chi u sáng r c r trên n nt iv i tương ph n phát hi n ư c. Phông n n phía sau ch t không huỳnhquang càng t i thì thi t b càng có hi u qu . Hình 3 bi u di n m t hình dung có tính hình h c v s ki n x y ra khi m tm u v t huỳnh quang ư c quan sát b ng m t kính hi n vi huỳnh quang. Ánh sángt ngo i có bư c sóng ho c t p h p bư c sóng nh t nh ư c t o ra b ng cách choánh sáng phát ra t ngu n phát t ngo i i qua b l c kích thích. Ánh sáng t ngo i ư c l c s chi u sáng m u v t, trong trư ng h p này là tinh th fluorite, ch t sphát ra ánh sáng huỳnh quang khi ư c r i sáng b ng ánh sáng t ngo i. Ánh sángkh ki n phát ra t m u v t, có màu trong hình 3, sau ó ư c l c qua m t t ml c ch n không cho ánh sáng t ngo i ph n x i qua. C n chú ý r ng ây là phươngth c hi n vi duy nh t trong ó m u v t, sau khi b kích thích, t o ra ánh sáng riêngc a nó. Ánh sáng phát x t a ra theo m i hư ng (góc 360 ), không c n bi t như ng c a ánh sáng kích thích. Hình 3. Nguyên lí kích thích và phát x Hi n vi huỳnh quang là công c nghiên c u vô giá và ph bi n nhanh chóng.L i th c a nó d a trên nh ng thu c tính mà các công ngh hi n vi quang khác Kĩ thu t hi n vi huỳnh quang | Trang 2/5không d gì có ư c. Vi c s d ng fluorochrome khi n nó có th nh n d ng ư ccác t bào và các thành ph n t bào h hi n vi và nh ng th c th khác có m c c trưng ca ...