Luân. văn : Xây dựng quy trình biến nạp đoạn DNA vào tế bào vi khuẩn E.coly DH5α part 4

Môi trường LB agar, kháng sinh ampicillyn, X-gal, IPTG (bacto tryptone, bacto yeast extract, natri chlorua, agar. Ampicillyn, X-gal, IPTG ) 3.2.5 Các loại hóa chất dùng trong thí nghiệm Hóa chất dùng cho PCR (được cung cấp bởi công ty Bio-rad) iTaq polymerase MgCl2 dNTPs PCR buffer Các loại hoá chất khác Tryptone Bacto yeast extract Natri chlorua Canxi chlorua X-gal IPTG Kháng sinh Ampicillyn Glucose Tris- HCl pH 8.0 3.2.6 Các loại enzym dùng trong thí nghiệm BamHI với trình tự nhận biế ...
Nội dung trích xuất từ tài liệu:
Luân. văn : Xây dựng quy trình biến nạp đoạn DNA vào tế bào vi khuẩn E.coly DH5α part 4 Môi trường LB agar, kháng sinh ampicillyn, X-gal, IPTG (bacto tryptone, bactoyeast extract, natri chlorua, agar. Ampicillyn, X-gal, IPTG )3.2.5 Các loại hóa chất dùng trong thí nghiệm Hóa chất dùng cho PCR (được cung cấp bởi công ty Bio-rad) iTaq polymerase MgCl2 dNTPs PCR buffer Các loại hoá chất khác Tryptone EDTA Bacto yeast extract Sodium dodecyl sulfat (SDS) Natri chlorua Natri hydroxide Canxi chlorua Glacial acetic X-gal Potassium acetat IPTG Glycerol 70% Kháng sinh Ampicillyn Bromophenol blue Glucose Ethidiumbromide Tris- HCl pH 8.03.2.6 Các loại enzym dùng trong thí nghiệm BamHI với trình tự nhận biết: G GATCC (Roche, Cat.No. 220 612) CCTAG G EcoRV với trình tự nhận biết: GAT ATC (Roche, Cat.No. 667 145) CTA TAG Hind III với trình tự nhận biết: A AGCTT (Roche, Cat.No. 656 313) TTCGA A DNA T4 lygase (usb, Product No. 70005Y) do công ty Amersham cung cấp. DNA Polymerase I large fragment (Klenow) (BioLabs, Code number M0210S) docông ty Bio-rad cung cấp. 253.3 Phương pháp nghiên cứu3.3.1 Quy trình biến nạp plasmid vào tế bào vi khuẩn Nhiễm sắc thể + CaCl2 + DNA plasmid Màng tế bào trở nên khả nạp sốc nhiệt ổn định tế bào Màng tế bào hồi phục plasmid bắt đầu sao chép Nhân sinh khối, tách chiết plasmid,kiểm tra Sơ đồ 3.2 Quy trình biến nạp plasmid vào tế bào vi khuẩn. 263.3.2 Quy trình biến nạp đoạn DNA vào vi khuẩn E.coly DH5α và kiểm tra + CaCl2 Khả nạp Vi khuẩn Ecoly DH5α Plasmid Bluescript II SK (+/-) Sốc nhiệt Vi khuẩn mang plasmid Bluescript Đoạn DNA Chọn lọc khuẩn lạc màu xanh Chiết tách plasmid Blunt - end Cắt plasmid bằng EcoRV Tinh sạch Tinh sạch Phản ứng nối Biến nạp vào khả nạp Chọn lọc khuẩn lạc màu trắng Chiết tách plasmid Cắt plasmid bằng BamHI, HindIII Phản ứng PCR với primer T3, T7Sơ đồ 3.3 Quy trình biến nạp đoạn DNA vào vi khuẩn E.coly DH5α và kiểm tra. 273.3.3 Xác định mật số vi khuẩn bằng cách đo OD600nm kết hợp với phương phápđếm khuẩn lạc trên môi trường LB agar3.3.3.1 Nguyên tắc Khi một pha lỏng có chứa nhiều phần tử không tan, thì sẽ tạo thành một hệ huyềnphù và có độ đục bởi các phần tử hiện diện trong môi trường lỏng cản ánh sáng, làmphân tán chùm sáng tới. Tế bào vi sinh vật là một thực thể nên khi hiện diện trong môitrường cũng làm cho môi trường trở nên đục. Độ đục của huyền phù tỷ lệ với mật độ tếbào. Trong một giới hạn nhất định của độ đục và mật độ tế bào, có thể xác lập đượcquan hệ tỷ lệ tuyến tính giữa mật độ tế bào và độ đục. Do vậy có thể định lượng mậtđộ tế bào một cách gián tiếp thông qua việc đo OD ở các bước sóng từ 550 – 610 nm.Trong trường hợp này, phải thiết lập đường tương quan tuyến tính giữa giá trị OD vàmật độ tế bào kết hợp với phương pháp đếm trực tiếp.3.3.3.2 Cách tiến hành Cấy phân lập vi khuẩn E.coly DH5α từ ống gốc lên đĩa petri chứa môi trường LBagar. Ủ ở 370c từ 16-18 giờ Dùng que cấy bắt một khuẩn lạc (0.5-1mm) từ đĩa petri đã phân lập cho vào bìnhtam giác chứa 100ml môi trường LB lỏng, nuôi cấy lắc ở 370C, 150 vòng/phút. Sau 3giờ nuôi cấy bắt đầu tiến hành đo OD ở bước sóng 600nm, sử dụng môitrường LB lỏng để xây dựng đường chuẩn, lặp lại sau mỗi giờ nuôi cấy. Ở mỗi thời điểm lấy dịch nuôi cấy để đo OD ta cũng tiến hành đếm khuẩn lạc tạithời điểm đó bằng phương pháp đếm khuẩn lạc. Đếm khuẩn lạc 100μl 100μl 100μl 100μl 100μl 100μl 100μl 100μl dị ...