Luận văn : XÂY DỰNG QUY TRÌNH PHÁT HIỆN VIRUS PMWaV-1 GÂY BỆNH HÉO ĐỎ ĐẦU LÁ (Mealybug wilt) TRÊN CÂY DỨA CAYENNE BẰNG PHƯƠNG PHÁP RT-PCR part 6

51 4.3 Kết quả kiểm tra sản phẩm RT-PCR bằng phương pháp giải trình tự Các sản phẩm RT-PCR khi điện di trên gel agarose 1,5% đã thu được vạch DNA với kích thước 589 bp như mong đợi. Tuy nhiên, chưa thể đưa ra kết luận rằng đây chính là đoạn DNA đã nhân bản từ đoạn gene HSP 70 của PMWaV-1. Do đó, phương pháp giải trình tự được áp dụng để kiểm chứng lại các sản phẩm này. Có 2 mẫu sản phẩm RT-PCR dương tính trên điện di, một từ cây bệnh và một từ chồi...
Nội dung trích xuất từ tài liệu:
Luận văn : XÂY DỰNG QUY TRÌNH PHÁT HIỆN VIRUS PMWaV-1 GÂY BỆNH HÉO ĐỎ ĐẦU LÁ (Mealybug wilt) TRÊN CÂY DỨA CAYENNE BẰNG PHƯƠNG PHÁP RT-PCR part 6 51 4.3 Kết quả kiểm tra sản phẩm RT-PCR bằng phương pháp giải trình tự Các sản phẩm RT-PCR khi điện di trên gel agarose 1,5% đã thu được vạchDNA với kích thước 589 bp như mong đợi. Tuy nhiên, chưa thể đưa ra kết luận rằngđây chính là đoạn DNA đã nhân bản từ đoạn gene HSP 70 của PMWaV-1. Do đó,phương pháp giải trình tự được áp dụng để kiểm chứng lại các sản phẩm này. Có 2 mẫu sản phẩm RT-PCR dương tính trên điện di, một từ cây bệnh và mộttừ chồi giống thương phẩm bình thường (không có triệu chứng bệnh) đã được chọnđể đem giải trình tự. Do trong các quá trình giải trình tự trực tiếp trên sản phẩmPCR, máy thường không đọc được một số nucleotide đầu tiên nên trình tự của cácsản phẩm PCR giải ra bị mất một đoạn khoảng 20 nucleotide về phía đầu 5’, nơiprimer xuôi bắt cặp vào. Vì vậy, kết quả giải trình tự 2 sản phẩm RT-PCR thu được2 đoạn 566 bp và 568 bp. Bảng 4.4: Trình tự của sản phẩm RT-PCR Mẫu Trình tự (5’ – 3’) D1 NNNNNGATTTATGCTGTGGAAAGATTCAGGTTATCGTGATATAAAAAGGT ATTTCGGACTCAACAAGTTCAACAAAGATGTGTATCTCGATAAATTGAAA(566 bp) CCCACAATCGAGGTAGTGGTTGACGACTGGGGTTGTTCTATAGGACCAGT AGACGGTGCGAGAGGGAAAGCCAAATCAGTTCTCACTTTAGCCTCTGATT TTATAACGGGATTGGTACAACTAGCGATCAAGATGACGAATCAACAAGTA TCTGTGTCTGTTTGTTCAGTACCAGCAGCTTACAATTCTTATCAAAGGGG TTTTATTTTTGAAAGTTGTAAGTTGAGCTCTATAAATGTGCAGGCGGTAG TAAACGAACCGACCGCAGCTGGATTGAGTGCTTTCATAACTACCCCGAAA GCTTCTGTGAATTATTTGTTAGTCTACGATTTCGGAGGAGGCACTTTTGA TAGTTCCTTACTCGTGGTTGGGCCTGCGTACGTGGGAGTACTGGATTCGA TGGGAGATAACTATCTGGGAGGCAGGGACGTAGATAACAGATTGCTTAGT TTTTGGTGCGANNNNN 52 NNNNNCGCATTCTGCTGNTTGGAAGACTTGAGGTTATCGTGATATAAAAA D2 GGTATTTCGGACTCAACAAGTTCAACAAAGATGTGTATCTCGATAAATTG(568 bp) AAACCCACAATCGAGGTAGTGGTTGACGACTGGGGTTGTTCTATAGGACC AGTAGACGGTGCGAGAGGGAAAGCCAAATCAGTTCTCACTTTAGCCTCTG ATTTTATAACGGGATTGGTACAACTAGCGATCAAGATGACGAATCAACAA GTATCTGTGTCTGTTTGTTCAGTACCAGCAGCTTACAATTCTTATCAAAG GGGTTTTATTTTTGAAAGTTGTAAGTTGAGCTCTATAAATGTGCAGGCGG TAGTAAACGAACCGACCGCAGCTGGATTGAGTGCTTTCATAACTACCCCG AAAGCTTCTGTGAATTATTTGTTAGTCTACGATTTCGGAGGAGGCACTTT TGATAGTTCCTTACTCGTGGTTGGGCCTGCGTACGTGGGAGTACTGGATT CGATGGGAGATAACTATCTGGGAGGCAGGGACGTAGATAACAGATTGCTG AATTTTGTGTCCGAANNT Chú thích: D1: mẫu từ cây bệnh D2: mẫu từ chồi dứa thương phẩm N: các nucleotide không xác định được Thường ở đầu và cuối đoạn DNA được giải trình tự, các tín hiệu huỳnh quangmà máy thu được thường bị nhiễu nên đoạn này máy thường đọc trình tự khôngchính xác hoặc không xác định được trình tự tạo ra các N. Thống kê từ 2 trình tựtrên cho thấ y D1 có 10 N (chiếm 1,77 % tỷ lệ nucleotide), D2 có 7 N (chiếm 1,23 %tỷ lệ nucleotide). T ỷ lệ N thu được ở trên là rất thấp nên kết quả giải trình tự 2 mẫuD1, D2 là hoàn toàn chấp nhận được. Bước tiếp theo, 2 đoạn trình tự vừa giải được đem so sánh với các trình tựchuẩn đã được công bố trên GenBank để có thể khẳng định đó chính là trình tự HSP70 của PMWaV-1. Ở đây phần mềm Clustal X 1.83 được sử dụng để xác định độtương đồng của 2 trình tự được giải với trình tự HSP 70 tiêu chuẩn tải về từ NCBI.Như đã nói ở trên, các tín hiệu thu được ở 2 đầu của các trình tự D1, D2 rất xấu,không rõ ràng nên chúng tôi lấ y 1 đoạn trình tự đáng tin cậy nhất của 2 mẫu (dài 532bp) để tiến hành so sánh. 53 Bảng 4.5: Kết quả so sánh trình tự của sản phẩm RT-PCRMẫu Trình tựD1 AAAAGACTTAGAGGTTTATCGTGATATAAAAAGGTATTTCGGACTCAACAAGTTCAACAAD2 AAAAGACTTAGAGGTTTATCGTGATATAAAAAGGTATTTCGGACTCAACAAGTTCAACAAAF414119 AAAAGACTTAGAGGTTTATCGTGATATAAAAAGGTATTTCGGACTCAACAAGTTCAACAA ************************************************************D1 AGATGTGTATCTCGATAAATTGAAACCCACAATCGAGGTAGTGGTTGACGACTGGGGTTGD2 AGATGTGTATCTCGATAAATTGAAACCCACAATCGAGGTAGTGGTTGACGACTGGGGTTGAF414119 AGATGTGTATCTCGATAAATTGAAACCCACAATCGAGGTAGTGATTGACGACTGGGGTTG ******************************************* ****************D1 TTCTATAGGACCAGTAGACGGTGCGAGAGGGAAAGCCAAATCAGTTCTCACTTTAGCCTCD2 TTCTATAGGACCAGTAGACGGTGCGAGAGGGAAAGCCAAATCAGTTCTCACTTTAGCCTCAF414119 TCCTATAGGACCAGTAGACGGTGCGCGCGGGAAAGCCAAATCAGTTCTCACTTTAGCCTC * *********************** * ********************************D1 ...