Phân lập, tuyển chọn vi khuẩn lên men lactic từ rễ cây lúa (Oryza sativa) có hoạt tính hỗ trợ tăng trưởng cây trồng và kháng nấm gây bệnh đạo ôn (Pyricularia oryzae)

Ba chủng vi khuẩn RL1T, RL1V, RL2 được phân lập nội sinh từ rễ lúa thu được ở tỉnh Long An, 1 chủng RL được phân lập từ bề mặt rễ lúa Cà Mau. Cả 4 chủng vi khuẩn phân lập RL1T, RL1V, RL2, RL đều có khả năng sinh acid, sinh IAA, tạo màng biofilm và ức chế nấm bệnh đạo ôn Pyricularia oryzae trong điều kiện nồng độ muối từ 0-3%. Hai chủng có hoạt tính mạnh nhất RL và RL1T được định danh là Enterococcus faecium bằng phương pháp giải trình tự gene 16S rRNA và so sánh với các trình tự của Genbank.
Nội dung trích xuất từ tài liệu:
Phân lập, tuyển chọn vi khuẩn lên men lactic từ rễ cây lúa (Oryza sativa) có hoạt tính hỗ trợ tăng trưởng cây trồng và kháng nấm gây bệnh đạo ôn (Pyricularia oryzae) PHÂN LẬP, TUYỂN CHỌN VI KHUẨN LÊN MEN LACTIC TỪ RỄ CÂY LÚA (ORYZA SATIVA) CÓ HOẠT TÍNH HỖ TRỢ TĂNG TRƯỞNG CÂY TRỒNG VÀ KHÁNG NẤM GÂY BỆNH ĐẠO ÔN (PYRICULARIA ORYZAE) Đặng Ngọc Thanh*, Lê Khắc Khoa Điềm, Hồ Thị Dưỡng, Trần Quang, Nguyễn Tấn Lộc * Viện Khoa học Ứng dụng HUTECH, Trường Đại học Công nghệ TP. Hồ Chí Minh GVHD: TS. Nguyễn Hoài Hương TÓM TẮT Ba chủng vi khuẩn RL1T, RL1V, RL2 được phân lập nội sinh từ rễ lúa thu được ở tỉnh Long An, 1 chủng RL được phân lập từ bề mặt rễ lúa Cà Mau. Cả 4 chủng vi khuẩn phân lập RL1T, RL1V, RL2, RL đều có khả năng sinh acid, sinh IAA, tạo màng biofilm và ức chế nấm bệnh đạo ôn Pyricularia oryzae trong điều kiện nồng độ muối từ 0-3%. Hai chủng có hoạt tính mạnh nhất RL và RL1T được định danh là Enterococcus faecium bằng phương pháp giải trình tự gene 16S rRNA và so sánh với các trình tự của Genbank. Từ khóa: bệnh đạo ôn, hỗ trợ tăng trưởng cây trồng, kháng nấm, lúa, vi khuẩn lactic. 1 ĐẶT VẤN ĐỀ Lúa (Oryza sativa) là cây lương thực quan trọng hàng đầu nuôi sống khoảng 1/2 dân số và khoảng 3/4 người nghèo của thế giới. Ở Việt Nam, lúa là cây lương thực quan trọng nhất cho sinh kế của người dân và an ninh lương thực quốc gia [1]. Hiện nay bệnh đạo ôn đã và đang là nỗi ám ảnh nặng nề nhất đối với người trồng, tính kháng bệnh của giống liên tục bị phá vỡ do độc tính của nấm bệnh gây ra [2]. Thuốc hóa học được xem là biện pháp giải quyết phổ biến, nhưng gây tồn dư và ô nhiễm môi trường. Từ thực trạng cấp thiết đó, việc phân lập và tuyển chọn các chủng vi khuẩn lactic có hoạt tính sinh học cao nhằm hỗ trợ tăng trưởng cây trồng và kháng nấm bệnh đạo ôn thay thế cho thuốc bảo vệ thực vật và phân bón hóa học là một việc làm cấp thiết và thiết thực, góp phần xây dựng nền nông nghiệp sạch và bền vững. 2 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP 2.1 Vật liệu Nguồn phân lập: rễ lúa Nàng Hương, Nàng Thơm chợ Đào (Long An), rễ lúa OM6162 (Cà Mau). Nấm chỉ thị: nấm bệnh đạo ôn Pyricularia oryzae. Đối chứng dương kháng nấm: thuốc hóa học BEAM 75W (Tricyclazole 75% w/w). 466 2.2 Phương pháp 2.2.1 Phân lập vi khuẩn lên men lactic từ rễ lúa Phân lập vi khuẩn lactic sống trên bề mặt rễ lúa: rễ lúa được rửa sạch đất và ngâm trong NMSL, sau đó phân lập trên môi trường MRS agar bổ sung Azide 0,2% và Bromocresol purple (BCP) 0,4%, ủ ở nhiệt độ phòng trong 24 giờ. Phân lập vi khuẩn lactic nội sinh rễ lúa: rễ lúa sau khi được khử trùng bề mặt đến không phát hiện được vi sinh vật phát triển từ nước rửa rễ, sau đó rễ được nghiền trong NMSL và phân lập như trên. Xác định các đặc điểm hình thái, sinh lý sinh hoá: quan sát hình thái khuẩn lạc, hình thái tế bào, nhuộm gram, nhuộm bào tử, thử nghiệm catalase, khả năng di động, khả năng lên men đường [3]. Khả năng lên men đường được xác định bằng cách: Môi trường MRS broth lần lượt thay thế đường glucose thành các loại đường cần kiểm tra, bổ sung Bromocresol purple 0.4% và có ống Durham, hấp khử trùng và cấy vi khuẩn vào, để ở nhiệt độ phòng trong 24 giờ. Nếu môi trường đổi màu, đục và có bọt khí bên trong ống durham thì chủng vi khuẩn đó lên men dị hình. Đối với những ống nghiệm không có bọt khí trong ống durham thì cần kiểm tra lại bằng cách đốt đỏ que cấy và đặt sát bề mặt môi trường, nếu thấy có bọt khí nổi lên thì chủng vi khuẩn đó cũng lên men có sinh khí yếu. Đánh giá khả năng lên men qua mức độ đổi màu môi trường. 2.2.2 Tuyển chọn vi khuẩn có hoạt tính hỗ trợ ăng ưởng cây trồng và kháng nấm bệnh đạo ôn Tuyển chọn vi khuẩn lactic theo khả năng sinh acid (Phương pháp chuẩn độ Therner), khả năng tạo màng sinh học biofilm [4], khả năng sinh IAA theo phương pháp Salkowski [5], khả năng kháng nấm gây bệnh đạo ôn Pyricularia oryzae in vitro bằng phương pháp cấy hai đường song song [6]. 2.2.3 Định danh các chủng vi khuẩn tuyển chọn Các chủng thuần khiết được gửi đi công ty Phusa Biochem giải trình tự 16S rRNA bằng phương pháp Sanger và so sánh trên Genbank NCBI bằng phần mềm Blast. 3 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 3.1 Phân lập vi khuẩn lên men lactic từ rễ lúa Từ rễ lúa Long An phân lập được 3 chủng vi khuẩn nội sinh RL1T, RL1V, RL2; 1 chủng RL trên bề mặt từ rễ lúa Cà Mau. Đặc điểm khuẩn lạc và hình thái tế bào: Cả 4 chủng vi khuẩn RL1T, RL1V, RL2, RL đều có khuẩn lạc tròn, lồi, trắng đục, viền nhẵn. Đặc điểm sinh lý sinh hóa của 4 chủng được thể hiện qua bảng 1 và 2 thể hiện tính chất của vi khuẩn lên men lactic. Cả 4 chủng vi khuẩn đều có khả năng lên men đường glucose, fructose, galactose, mannose, mannitol, xylose, maltose, sucrose, lactose và đặc biệt cả dextrin, thể hiện qua đổi màu môi trường từ tím sang vàng, trong đa số trường hợp có sinh khí, chứng tỏ các chủng lên men dị hình, ngoài acid lactic còn có các acid hữu cơ khác. 467 Bảng 1. Đặc điểm sinh lý sinh hóa của 4 chủng phân lập Đặc điểm RL1T RL1V RL2 RL Gram + + + + Bào tử - - - - Di động - - - - Catalase - - - - Ghi chú: +: dương tính, -: âm tính Bảng 2. Khả năng lên men đường của 4 chủng phân lập Nguồn đường RL1T RL1V RL2 RL Glucose + +x +x +x Fructose ...