Phân tích acid amin bằng phương pháp sắc ký

Amino acid là đơn vị cấu trúc cơ bản của protein là chất hữu cơ mà phân tử chứa ít nhất một nhóm carboxyl và ít nhất một nhóm amino trừ prolin chỉ có nhóm NH(thực chất là một acid imin). Có khoảng hơn 20 loại amino acid khác nhau, do đó việc phân tích chúng để xác định thành phần axit amin hoặc hàm lượng của các protein, peptide, và các chế phẩm dược phẩm khác rất cần thiết.
Nội dung trích xuất từ tài liệu:
Phân tích acid amin bằng phương pháp sắc ký TRƯỜNGĐẠIHỌCNÔNGLÂMHUẾ KHOA CƠ KHÍ CÔNG NGHỆ ĐỀ TÀI : Phân tích acid amin bằng phương pháp sắc ký GVHD:PHẠMTRẦNTHÙYHƯƠNG NHÓM:2.5 A.ĐẶT VẤN ĐỀ A.Đ AminoacidlàđơnvịcấutrúccơbảncủaproteinlàchấthữucơmàphântửchứaítnhấtmộtnhómcarboxylvàítnhấtmộtnhómaminotrừprolinchỉcónhómNH(thựcchấtlàmộtacidimin). Cókhoảnghơn20loạiaminoacidkhácnhau,dođóviệcphântíchchúngđểxácđịnhthànhphầnaxitaminhoặchàmlượngcủacácprotein,peptide,vàcácchếphẩmdượcphẩmkhácrấtcầnthiết. B.NỘI DUNG B.NI.XửlýmẫuTạodẫnxuất1.Thủyphânprotien,peptideCónhiềucáchthủyphân:bằngaxit,kiềm,enzimtùyvàoloại thựcphẩmvàthànhphầncủaprotien. Thứtựthủyphân: +Đốtnónglòở105÷112oCkhoảng2030phúttrướckhithủy phân +Cânmẫuvàlàmgiàuprotein(tùyvàoloạithựcphẩm) +Dùngtácnhânđểthủyphân(nhưHClphảicóphenolđể ngăncảnhalogelhóacủatyrosin)2. Tạo dẫn xuất:2. Tăng độ nhạy trong quá trình phân tích người ta th ường Tăng tạo dẫn xuất acid amin, trong đó có các axit amin phản ứng với một tiền chất để mang lại khả năng hấp thụ m ạnh tia UV/Vis hoặc một tạo một hợp chất huỳnh quang. Có nhiều chất để tạo dẫn xuất với protien nh ư: Có o-phthalaldehyde (OPA), Phenylisothiocyanate (PITC), o-phthalaldehyde carbamate 6-aminoquinolyl-N-hydroxysuccinimidyl (AQC) ...Ứng với mỗi dẫn xuất thì chọn detector có bước (AQC) sóng khác nhau. Việc tạo dẫn xuất phải thực hiện qua nhi ều b ước.  Quy trình sấy khô Quy Chuẩn bị hóa chất,dung dịch dùng sấy khô lại Cho vào bình định mức Tiến hành sấy khô hút chân không cho đến khô ChuẩnbịdungdichdẫnxuấtChuẩnbịhỗnhợptheotỉlệcácchấttùyvàophươngphápdẫnxuấtTạodẫnxuấtRút20µlhỗnhợpdungdịchtạodẫnxuấtmớiphaởtrên,chovàomỗiốngmẫuđãsấykhôLắcvàigiây Đểyên20phútởnhiệtđộ2025oCSấykhô a. Phương pháp tạo dẫn xuất OPA o-phthalaldehyde hoặc ortho- phthalaldehyde (OPA) là các hợp chất hóa học với công thức C6 H4 (CHO)2. (CHO) Thường được viết tắt OPA, phân tử này là một dialdehyde bao gồm hai nhóm formyl (CHO) gắn liền kề trên một vòng benzene. Là chất rắn màu vàng nhạt được dùng trong việc tổng hợp các hợp chất dị vòng và là một OPA thuốc thử trong phân tích của các acid amin. a. Phương pháp tạo dẫn xuất OPA Ortho-phthalaldehyde (OPA) được hòa tan và ổn định trong dung dịch nước ở pH a. Phương pháp tạo dẫn xuất OPA a. Có 2 phương pháp tạo dẫn xuất OPA: tạo dẫn xuất ti ền cột(Precolumn derivatization) và tạo dẫn xuất sau c ột (derivatizationpostcolumn). Dẫn xuất tiền cột:  Nguyên tắc chung tạo Precolumn derivatization là tạo dẫn xuất của các axit amin với o- phthalaldehyde (OPA), tiếp theo là tách HPLC ngược pha, các sắc ký lỏng được trang bị một máy dò fluorometric để phát hiện các dẫn xuất acid amin. Cường độ huỳnh quang của phức OPA- acid amin được theo dõi với bước sóng kích thích 348 nm và bước sóng phát xạ 450 nm. a. Phương pháp tạo dẫn xuất OPADẫn xuất tiền cột:  ophthalaldehyde(OPA)phản ứngvớicácacidamin với sự có mặt của hợp chất thiol để hình thành các sản phẩm huỳnh quang. N-acetyl-L-cysteine và 2 -mercaptoethanol có thể được sử dụng như là các thiol.  OPAtựnókhôngpháthuỳnhquangvàdo đókhông ảnhhưởngđếnkếtquảphântích. a. Phương pháp tạo dẫn xuất OPADẫn xuất tiền cột:  Độ hòa tan và độ ổn định của nó trong dung dịch nước cùng với tốc độ phản ứng nhanh nên có thể tạo dẫn xuất tự động và phân tích bằng cách sử dụng một máy lấy mẫu tự động, dẫn xuất này có độ nhạy rất cao, giới hạn phát hiện tối thiểu là 50 fmol (10 -15mol) mol)  Tuy nhiên, vì không có khả năng phản ứng với acid amin thứ cấp nên làm hạn chế ưu thế của phương pháp tạo dẫn xuất này. Phương pháp này không phân tích được các acid amin thứ cấp (ví dụ như proline).a. Phương pháp tạo dẫn xuất OPADẫnxuấtsaucột  Nguyên tắc tạo dẫn xuất sau cột là sử dụng cột trao đổi ion để tách các axit amin tự do, tiếp theo là quá trình oxy hóa các acid amid bằng hypochlorite natri rồi thực hiện phản ứng với OPA với sự có mặt của hợp chất thiol như N-acetyl-L-cysteine và 2-mercaptoethanol  Mặc dù OPA không phản ứng với các amin thứ cấp ( proline) để tạo thành các chất huỳnh quang, nhưng quá trình oxy hóa bằng hypochlorite natri cho phép các amin thứ cấp phản ứng với OPA. a. Phương pháp tạo dẫn xuất OPADẫnxuấtsaucột  Cường độ huỳnh quang của phức OPA- acid amin được đo với một bước sóng kích thích 348 nm và phát xạ bước sóng 450 nm vì vậy khi tiến hành phân tích dùng đầu dò huỳnh quang 348nm.  Giới hạn phát hiện tối thiểu khoảng một vài chục pmol cho hầu hết các dẫn xuất acid amin, tuyến tính trong phạm vi của một vài pmol đến vài chục nmol.  So với dẫn xuất tiền cột thì dẫn xuất này có độ nhạy thấp hơn tuy nhiên ưu điểm là có thể phân tích được acid amin thứ cấp. b. Phương pháp tạo dẫn xuất NBD-F Nguyên tắc chung tạo dẫn xuất NBDF là phản ứng của các acid amin với 7fluoro4 nitrobenzo2oxa1.3diazole (NBDF), NBD Fphản ứngvớicácacidaminkểcảcácacid amin thứ cấp để tạo thành sản phẩm cao huỳnh quang, tiếp theo là tách HPLC pha đảo với sử dụng đầu dò huỳnh quang bước són ...