PHÂN TÍCH BIỂU HIỆN CỦA CTB (CHOLERA TOXIN B SUBUNIT) TRONG CÂY CÀ CHU

Chúng tôi đã phân tích sự biểu hiện của tiểu đơn vị B độc tố cholera (CTB) trong cây cà chua (Lycopersicon esculentum L.). Gen mã hóa CTB thích hợp với thực vật được dung hợp với trình tự SEKDEL và tạo dòng trong vector biểu hiện bên cạnh promoter CaMV 35S. Gen CTB sau đó được biến nạp vào cây cà chua thông qua Agrobacterium tumefaciens.
Nội dung trích xuất từ tài liệu:
PHÂN TÍCH BIỂU HIỆN CỦA CTB (CHOLERA TOXIN B SUBUNIT) TRONG CÂY CÀ CHU Tuyển tập Báo cáo Hội nghị Sinh viên Nghiên cứu Khoa học lần thứ 7 Đại học Đà Nẵng năm 2010 PHÂN TÍCH BIỂU HIỆN CỦA CTB (CHOLERA TOXIN B SUBUNIT) TRONG CÂY CÀ CHUA (LYCOPERSICON ESCULENTUM L.) EXPRESSION OF CTB (CHOLERA TOXIN B SUBUNIT) IN TOMATO (LYCOPERSICON ESCULENTUM L.) SVTH: Nguyễn Khắc Tiệp Lớp 05SH, Khoa Hóa, Trường Đại học Bách khoa GVHD: PGS.TS. Nguyễn Hoàng Lộc, ThS. Lê Thị Thính Viện Tài nguyên, Môi trường và Công nghệ sinh học, Đại học Huế TÓM TẮT Chúng tôi đã phân tích sự biểu hiện của tiểu đơn vị B độc tố cholera (CTB) trong cây cà chua(Lycopersicon esculentum L.). Gen mã hóa CTB thích hợp với thực vật được dung hợp với trình tự SEKDELvà tạo dòng trong vector biểu hiện bên cạnh promoter CaMV 35S. Gen CTB sau đó được biến nạp vào câycà chua thông qua Agrobacterium tumefaciens. Sáu dòng cây chuyển gen riêng lẽ được tá i sinh trên môitrường chứa kanamycin sau 2 tháng. Khuếch đại DNA genomic cà chua bằng phản ứng PCR đã chứng minhsự có mặt của CTB trong cây cà chua. Sự biểu hiện và tự lắp ráp của protein CTB thành cấu trúc oligomerbằng kích thước pentamer được xác định bằng phân tích Western blot. Protein CTB tái tổ hợp trong cây càchua có ái lực mạnh với GM1-ganglioside gợi ý rằng CTB đã bảo tồn những vị trí kháng nguyên cần cho liênkết và gấp nếp thích hợp thành cấu trúc pentamer. ABSTRACT W e analysed expressing of the B subunit of cholera toxin (CTB) in tomato (Lycopersicon esculentumL.). Gene encoding the CTB adapted to the coding sequence of plants was fused to the endoplasmicreticulum retention signal (SEKDEL) to enhance its level of expression in plants and w as cloned into a plantexpression vector adjacent to the CaMV 35S promoter. The CTB gene was then introduced into tomato plantby Agrobacterium tumefaciens-mediated transformation method. Six independent transgenic lines wereregenerated on medium containing kanamycin after 2 months of culture. PCR amplification of genomic DNAconfirmed the presence of the CTB in the transgenic tomato plants. Expression and assembly of CTB proteininto oligomeric structures of pentameric size were observed in transgenic pla nt extracts by Western blotanalysis. The recombinant CTB protein synthesized in the tomato plants showed strong affinity for GM1 -ganglioside suggesting that the CTB conserved the antigenic sites for binding and proper folding ofpentameric CTB structure.1. Mở đầu CTB là tiểu đơn vị liên kết của độc tố cholera (CT-cholera toxin) của vi khuẩn Vibriocholerae, một loại vi khuẩn gây bệnh tả ở nhiều nước đang phát triển. Độc tố CT có khối lượngphân tử 84 kDa, bao gồm các tiểu đơn vị (subunit) A và B. Hai tiểu đơn vị A và B liên kết với nhaubằng cầu nối disulfide. Tiểu đơn vị B chứa 5 chuỗi polypeptide giống nhau và liên kết với các điểmthụ cảm glucosphingolipid trên bề mặt tế bào eukaryote [6]. Tiểu đơn vị A chui qua màng tế bào vàhoạt hóa enzyme adenylcysla - của tế bào ruột và giảm hấp thu NaCl của các nhung maoruột và nước từ tế bào chảy vào lòng ruột dẫn đến tiêu chảy [13]. Một số nghiên cứu trên động vậtmô hình cho thấy CTB tái tổ hợp có thể kích thích các đáp ứng miễn dịch niêm mạc và màng nhầyđể chống lại CT (Jiang et al., 2007). Vì vậy, CTB là một ứng viên kháng nguyên đầy hứa hẹn trongsản xuất vaccine phòng bệnh tả. 385 Tuyển tập Báo cáo Hội nghị Sinh viên Nghiên cứu Khoa học lần thứ 7 Đại học Đà Nẵng năm 2010 Vaccine thực vật đã thu hút nhiều sự chú ý và đã trở thành tiêu điểm nghiên cứu và pháttriển mạnh từ năm 1990 khi Curtiss và cộng sự lần đầu tiên thông báo về sự biểu hiện của khángnguyên bề mặt của Streptococcus mutans (SpaA) trong cây thuốc lá [15]. Đến nay đã có nhiềuprotein kháng nguyên được biểu hiện thành công trong thực vật như protein kháng nguyên bề mặtcủa virus viên gan B (HBsAg-hepatitis B surface antigen) [3]; protein kháng nguyên của virus viêmgan E (HEV-hepatitis E virus) [10]; tiểu đơn vị B của độc tố E. coli mẫn cảm với nhiệt (LTB-theEscherichia coli heat-labile enterotoxin B subunit) [5]. Tiểu đơn vị B của độc tố cholera (CTB-cholera toxin B subunit) cũng được biểu hiện trong cây thuốc lá, cây khoai tây, cây cà rốt , cây raudiếp... [2,6,7]. Sản xuất protein kháng nguyên trong cây trồng rẻ hơn sản xuất bằng cách nuôi cấy vikhuẩn, nấm, tế bào côn trùng hoặc tế bào động vật có vú. Mặt khác, các kháng nguyên có nguồn gốcthực vật an toàn cho người hơn các kháng nguyên có nguồn gốc từ động vật và vi sinh v ...