SỬ DỤNG KỸ THUẬT PHÂN TỬ ĐỂ XÁC ĐỊNH NẤM

ADN cung cấp rất nhiều các đặc điểm để xác định các loài nấm mà nhiều loài nấm không có đầy đủ các đặc điểm về hình thái học hoặc chỉ có các đặc điểm có thể phân biệt được ở một giai đoạn nhất định nào đó trong chu kỳ sống của chúng. Các phương pháp sử dụng kỹ thuật ADN rất khác nhau, hiện nay các kỹ thuật dựa vào sự biến động của phương pháp PCR rất phổ biến bởi tính nhạy của nó, khả năng xác định nhanh và chỉ cần sử dụng một lượng vật...
Nội dung trích xuất từ tài liệu:
SỬ DỤNG KỸ THUẬT PHÂN TỬ ĐỂ XÁC ĐỊNH NẤM SỬ DỤNG KỸ THUẬT PHÂN TỬ ĐỂ XÁC ĐỊNH NẤM Trần Thanh Trăng Phòng Nghiên cứu Bảo vệ Thực vật rừng Viện Khoa học Lâm nghiệp Việt Nam TÓM TẮT ADN cung cấp rất nhiều các đặc điểm để xác định các loài nấm mà nhiều loài nấm không có đầy đủ các đặc điểm về hình thái học hoặc chỉ có các đặc điểm có thể phân biệt được ở một giai đoạn nhất định nào đó trong chu kỳ sống của chúng. Các phương pháp sử dụng kỹ thuật ADN rất khác nhau, hiện nay các kỹ thuật dựa vào sự biến động của phương pháp PCR rất phổ biến bởi tính nhạy của nó, khả năng xác định nhanh và chỉ cần sử dụng một lượng vật liệu đầu vào rất ít. Một số phương pháp phổ biến đã được áp dụng một cách rộng rãi trong các lĩnh vực khác nhau như xác định chất lượng thực phẩm, sinh thái rừng, con người, động vật và bệnh thực vật được mô tả. Phương pháp xác định cụ thể áp dụng cho các trường hợp phụ thuộc vào nhiều yếu tố, bao gồm số lượng mẫu và số lượng loài cần xác định. Tất cả các kỹ thuật sử dụng ADN đều phụ thuộc vào nguồn mẫu tiêu bản với những mô tả chi tiết về mặt hình thái nhằm khảng định sự chính xác và tin cậy của kỹ thuật ADN. Từ khoá: Kỹ thuật ADN, PCR, xác định trình tự chuỗi ADN GIỚI THIỆU Kỹ thuật phân tử (kỹ thuật ADN) là một công cụ rất quan trọng trong việc xác định nấm. Các kỹ thật này rất hữu ích, được sử dụng như là một công cụ để xác định nấm đặc biệt khi nó không sản sinh ra thể quả, hay bào tử, đó là các đặc điểm cơ bản để phân loại, mô tả loài bằng phương pháp hình thái học. Trong khi một số loài nấm có thể dễ dàng phân lập và có thể sản sinh ra các đặc điểm phân loại có thể sử dụng kính hiển vi để phân loại, một số loài khác lại rất khó để phân lập hoặc thậm chí khi đã phân lập được rồi nhưng không sản sinh ra các đặc điểm để phân loại. Nhu cầu xác định nấm bệnh nhanh như trong quá trình kiểm dịch tại các cửa cảng, áp dụng các biện pháp an toàn sinh học, cũng có thể sử dụng kỹ thuật ADN. Việc xác định các loài nấm có liên quan đến thực vật sử dụng kỹ thuật ADN cũng có rất nhiều ứng dụng, như là xác định các loài nấm rễ có ích, kiểm soát sự hiện diện của nấm cộng sinh hoặc quản lý nuôi cấy sinh học và phát hiện, xác định sớm được các loài nấm gây bệnh trên các cây chủ, từ đó có chiến lược quản lý bệnh hại. Khái niệm cơ bản về ADN ADN (Deoxyribo Nucleic Acid) là một phân tử dài, cấu tạo bởi một số lượng lớn các Nucleotite, được gọi là các bazơ hoặc cặp bazơ (base paire - bp). Mỗi Nucleotite bao gồm một phân tử đường 5 Các-bon, Deoxyribose với một nhóm Phốt-phát gắn ở vị trí Các-bon 5 và một trong bốn bazơ gắn ở vị trí Các-bon 1 (hình 1). Bốn bazơ là Adenine, Guanine, Cytosine và Thymine, thường được viết tắt là A, G, C và T. Khi một chuỗi ADN được tổng hợp, nhóm Phốt-phát của một Nucleotite được gắn vào vị trí số 3 của nhóm Hydroxyl của Nucleotite sau trong chuỗi phản ứng. 1 Bazơ: adenosine Nhóm phốt-phát Đường, deoxyribose Hình 1. Deoxyadenosine triphosphate (dATP) một trong 4 Deoxynucleotides (dNTPs) cần thiết để tổng hợp ADN (Watson và cs, 1998). ADN tồn tại trong tế bào dưới dạng sợi đôi, được gắn kết với nhau bởi các lực điện từ giữa các bazơ của sợi 1 và sợi 2. Guanine được gắn với Cytosine, Adenine được gắn với Thymine và các cặp này được gọi là “cặp bù”, sợi đôi này rất bền vững ở các điều kiện sinh lý của tế bào. Enzyme ADN là một loại enzyme, có chức năng tổng hợp ADN bằng việc copy chính xác một sợi ADN có sẵn. Tuy nhiên, chúng không tạo ra một chuỗi sợi mới giống hệt chuỗi ban đầu mà là một chuỗi sợi đối xứng ngược. Hai chuỗi sợi ADN được tách ra và một chuỗi đối xứng ngược được tạo ra bởi mỗi sợi bởi vậy sợi 1 là bản mẫu cho sợi mới thứ 2 và ngược lại. Chúng là thứ tự hoặc chuỗi của các bazơ A, C, G và T và đây chính là cơ sở cung cấp thông tin di truyền và được truyền từ tế bào này sang tế bào khác, từ thế hệ này sang thế hệ khác và việc xác định thứ tự các Nucleotite của chuỗi này được gọi là xác định trình tự ADN. Phương pháp Có rất nhiều phương pháp sử dụng kỹ thuật ADN để xác định nấm và sự lựa chọn phương pháp phù hợp nhất sẽ phụ thuộc vào số lượng mẫu và số lượng loài cần xác định. Tuy nhiên, tất cả các phương pháp được sử dụng đều dựa trên cơ sở khớp thông tin giữa một loài nấm chưa biết với một loài nấm đã được xác định bằng các đặc điểm hình thái học từ các tiêu bản mẫu. Do vậy việc xác định các loài nấm phụ thuộc vào các loài nấm đã được xác định từ trước bởi các nhà phân loại học với các kỹ năng phù hợp, cơ bản. Các cơ sở dữ liệu về trình tự chuỗi ADN công cộng có thể được sử dụng như là một nguồn thông tin quan trọng. Các phương pháp sử dụng kỹ thuật ADN để xác định nấm bệnh bao gồm: (1) Southern blot, (2) các kỹ thuật dựa trên PCR (PCR-based) như: PCR-RFLP (PCR Restriction Fragment Length Polymorphism - Đa hình các đoạn cắt giới hạn), T-RFLP (Terminal restriction fragment length polymorphism), và xác định trình tự chuỗi ADN (ADN sequencing). Bước đầu tiên cho tất cả các phương pháp trên là việc tách ADN và tinh sạch chúng, hiện nay có rất nhiều phương pháp và bộ kít được sử dụng để làm việc trên. Phương pháp Southern blot bao gồm việc gắn các ADN cần xác định vào một màng mỏng, sau đó tách các ADN đó ra và cho chúng gắn với một đoạn dò ADN (ADN-probe) đã được xác định (Goodwin và cs, 1989). Đoạn dò này là một đoạn ADN ngắn (khoảng 20 bp) và nó được thiết kế duy nhất cho một loài nấm. Bởi vì phương pháp này đòi hỏi phải có một số 2 lượng rất lớn các đoạn dò do vậy phương pháp này không được sử dụng một cách rộng rãi và được thay thế bằng phương pháp PCR. Phương pháp PCR được phát triển từ những năm 1980 với ...