Tạp chí khoa học: Tách dòng cDNA mã hóa cho thụ thể neurokinin-1 từ mô não người Việt Nam

Trong bài báo này, trình bày kết quả phân lập cDNA hoàn chỉnh từ mô não, trình tự nucleotide và trình tự amino acid suy diễn của NK-1R của người Việt. Sự sai khác ở 4 amino acid so với dữ liệu gốc trong Databank không làm ảnh hưởng đến tính xuyên màng của thụ thể nhưng có thể có ái lực liên kết khác nhau với các loại phối tử.
Nội dung trích xuất từ tài liệu:
Tạp chí khoa học: Tách dòng cDNA mã hóa cho thụ thể neurokinin-1 từ mô não người Việt NamTạp chí Khoa học ĐHQGHN, Khoa học Tự nhiên và Công nghệ, Tập 29, Số 4 (2013) 24-28Tách dòng cDNA mã hóa cho th th neurokinin-1 t mô não ngư i Vi t NamVõ Th Thương Lan1,*, Phan Hà M 1, inh oàn Long1,21Phòng thí nghi m tr ng i m Công ngh enzyme-protein, Trư ng i h c Khoa h c t nhiên, 334 Nguy n Trãi, Thanh Xuân, Hà N i, Vi t Nam 2 Khoa Y Dư c, i h c Qu c Gia Hà N i, 144 Xuân Th y, C u Gi y, Hà N i, Vi t NamNh n ngày 08 tháng 8 năm 2013 Ch nh s a ngày 22 tháng 8 năm 2013; ch p nh n ăng ngày 05 tháng 9 năm 2013Tóm t t. Th th neurokinin-1 (NK-1R) thu c nhóm các th th xuyên màng liên k t v i G protein (GPCR). NK-1R óng vai trò quy t nh s s ng còn c a các t bào th n kinh, tham gia vào vi c i u hòa các ph n x nôn, các ch c năng v tim m ch, hô h p và i u ch nh các hành vi ph n x . Ái l c liên k t v i ph i t ph thu c vào s a d ng trình t amino acid c a NK-1R. NK1R tái t h p ư c bi u hi n trong h th ng t bào ng v t ư c s d ng sàng l c các ch t i kháng c nh tranh (ch t i v n) v i ph i t trong s n xu t các bi t dư c. Trong bài báo này, chúng tôi trình bày k t qu phân l p cDNA hoàn ch nh t mô não, trình t nucleotide và trình t amino acid suy di n c a NK-1R c a ngư i Vi t. S sai khác 4 amino acid so v i d li u g c trong Databank không làm nh hư ng n tính xuyên màng c a th th nhưng có th có ái l c liên k t khác nhau v i các lo i ph i t . Do ó, cDNA hoàn ch nh c a ngư i Vi t t o cơ s bi u hi n NK-1R trong t bào ng v t sàng l c dư c li u Vi t Nam. T Khóa: Th th neurokinin-1 (NK-1R), Th th k t c p G-protein (GPCR), Ch t i kháng th th , ngư i Vi t Nam.1. T ng quan∗ Th th neurokinin-1 (NK-1R) thu c nhóm các th th xuyên màng liên k t v i G protein và ư c bi u hi n nhi u nh t não [1]. NK-1R liên k t ch y u v i ch t P ngoài t bào và G protein trong t bào, t ó truy n t i các tín hi u au n và gây áp ng sinh lí cho t bào [2]. NK-1R óng vai trò quy t nh s s ng còn c a các t bào th n kinh, tham gia vào vi c i uhòa các ph n x nôn, các ch c năng v tim m ch, hô h p và i u ch nh các hành vi ph n x khác nhau [3]. Ngoài ra, NK-1R còn tham gia vào s bài ti t ư ng ru t, i u ti t mi n d ch hay co bóp c a cơ trơn trong cơ th [4, 5]. c bi t, Rosso và c ng s ã ch ng minh vai trò c a NK-1R liên quan n phát tri n kh i u ác tính [6]. Gen mã hóa cho NK-1R là gen ơn b n. ngư i, gen này n m trên nhi m s c th s 2, có 5 exon. Trình t nucleotide c a gen NK1 ư c Takahashi và c ng s công b năm 1991. Trong 24_______∗Tác gi liên h . T: 84-0988551068 E-mail: vothithuonglan@hus.edu.vnV.T.T. Lan và nnk. /Tạp chí Khoa học ĐHQGHN, Khoa học Tự nhiên và Công nghệ, Tập 29, Số 4 (2013) 24-2825th i gian này, trình t cDNA mã hóa cho th th NK1 ngư i cũng ư c công b b i Hopkins và c ng s [7]. Trình t protein c a th th NK-1R có 407 amino acid c ba i tư ng là ngư i, chu t nhà và chu t ng. Trình t amino acid c a NK-1R ngư i và chu t có tương ng cao 99%, ch sai khác 22 amino acid. S sai khác này không nh hư ng nhi u n liên k t v i ch t P ho c m t s ch t tín hi u khác. Tuy nhiên, ái l c liên k t gi a các d ng NK-1R này v i các lo i thu c ho c dư c li u có s thay i rõ r t [8, 9]. Vì v y, phân l p các gen mã hóa cho NK-1R t các t c ngư i các vùng a lý khác nhau c bi t có ý nghĩa trong nghiên c u ch t i kháng th th . Các ch t i kháng th th là ph i t (có th là các thu c có b n ch t hóa h c khác nhau) liên k t v i th th nhưng không gây ra các ph n ng sinh h c ho c làm gi m hay khóa các ph n ng trung gian c a ch t ch v n. Thu c i kháng th th c nh tranh v i các ph i t n i sinh liên k t v i th th . Tương t như v y, ch t i kháng NK-1R là các h p ch t hay các dư c li u có ái l c liên k t cao v i NK-1R, tranh ch p v trí liên k t c a ch t P và không gây ra các áp ng c a cơ th khi liên k t v i th th này [10]. Vào năm 1980, ch t i kháng v i các ph i t g n th th NK1 u tiên ư c t ng h p thúc y m nh m các nghiên c u v thu c i kháng NK-1R [3]. Hi n nay, các thu c i kháng NK-1R tham gia vào h tr i u tr lâm sàng các b nh ch y u liên quan n th n kinh tr m c m, stress, ch ng au n a u, gi m au, các tri u ch ng c a tâm th n r i lo n th n kinh ho c trong h tr b nh nhân hóa tr li u [8, 9]. M c dù NK-1R và ch t i kháng NK-1R có ng d ng r ng rãi trong lĩnh v c y, dư c, nhưng các nghiên c u v NK-1R Vi t Namv n còn r t ít ho c chưa ư c công b . Nghiên c u này c a chúng tôi trình bày k t qu phân l p cDNA hoàn ch nh mã hóa cho NK-1R t ngư i Vi t Nam nh m m c ích ch ng bi u hi n th th này cho các nghiên c u ti p theo v sàng l c các ch t i kháng t dư c li u Vi t Nam.2. Nguyên li u và phương pháp M u u não sau ph u thu t ư c gi ngay trong nitơ và ư c s d ng tách chi t ARN t ng s b ng PureLink Kit (Invitrogen). Hai µg RNA t ng s ư c dùng làm khuôn trong ph n ng phiên mã ngư c t ng h p cDNA s d ng oligoT và enzyme Reverse Transcriptase (Invitrogen). Ph n ng ư c th c hi n theo quy trình hư ng d n c a Invitrogen. Ph n ng RT-PCR ư c th c hi n khu ch i riêng bi t hai o n 5’ và 3’ c a cDNA b ng các c p m i NK1 F: 5’ CGAAATGGATAACGTCCT CCC 3’ và NK1 R1: 5’ GCCAGCAGATGGCGA AGG 3’ (nhân b n o n 5’), c p m i NK1 F1: 5’ GATCTACTTCCTCCCCCTGC 3’ và NK1 R: 5’ CAAGTCCCAGTGTGAGGGTG 3’ (nhân b n o n 3’). Ph n ng s d ng 5 µl cDNA v i chu trình nhi t l p l i 40 chu kỳ (94oC 5 phút; 60oC 30’’; 72oC 90’’). S n ph m sau ó ư c x lý v i enzyme SmaI và n i v i nhau nh DNA ligase t o nên cDNA hoàn ch nh tách dòng trong vector pJET1.2 và bi n n p vào E. coli DH5. Các ph n ng PCR u s d ng enzyme Pfu Taq polymerase có ho t tính c s a m b o tính chính xác trong quá trình nhân b n.Trình t cDNA ư c xác nh trên máy t ng. Sơ ph n ng ư c trình bày trên Hình 1.26V.T.T. Lan và nnk. /Tạp chí Khoa học ĐHQGHN, Khoa học Tự nhiên và Công nghệ, Tập 29, Số 4 (2013) 24-28Hình 1. Sơ phân l p cDNA th th NK1 s d ng các c p m i nhân b n vùng 5’ và vùng 3’ riêng bi t.S n ph m 1,4 kb ư c tinh s ch b ng Kit QIAquick Gel Extraction (Qiagen), ư c ...