Thí nghiệm nuôi cấy mô và tế bào thực vật - Bài 3

Nuôi cấy đỉnh sinh trưởngI. Mục đích và yêu cầuMột phương thức dễ dàng nhất để đạt được mục tiêu trong nuôi cấy mô và tế bào thực vật là nuôi cấy đỉnh sinh trưởng (bao gồm nuôi cấy chồi đỉnh và chồi bên). Môi trường thích hợp thay đổi tùy theo từng loại cây trồng được đưa vào nuôi cấy nhưng cơ bản là môi trường chứa đầy đủ chất dinh dưỡng khoáng vô cơ và hữu cơ, được bổ sung chất kích thích sinh trưởng thích hợp. ...
Nội dung trích xuất từ tài liệu:
Thí nghiệm nuôi cấy mô và tế bào thực vật - Bài 3 168http://www.ebook.edu.vnBài 3 Nuôi cấy đỉnh sinh trưởngI. Mục đích và yêu cầu Một phương thức dễ dàng nhất để đạt được mục tiêu trong nuôicấy mô và tế bào thực vật là nuôi cấy đỉnh sinh trưởng (bao gồm nuôi cấychồi đỉnh và chồi bên). Môi trường thích hợp thay đổi tùy theo từng loạicây trồng được đưa vào nuôi cấy nhưng cơ bản là môi trường chứa đầy đủchất dinh dưỡng khoáng vô cơ và hữu cơ, được bổ sung chất kích thíchsinh trưởng thích hợp. Từ một đỉnh sinh trưởng sau một thời gian nuôi cấynhất định sẽ phát triển thành một chồi hay nhiều chồi. Sau đó chồi tiếp tụcphát triển vươn thân, ra lá và rễ trở thành một cây hoàn chỉnh. Cây conđược chuyển ra đất có điều kiện sinh trưởng phát triển bình thường. Đây làmột chu trình ngắn nhất và tiện lợi hơn các phương thức nhân giống thôngthường, được thực hiện bằng kỹ thuật nhân giống vô tính in vitro thôngqua nuôi cấy đỉnh sinh trưởng. Khi chọn đỉnh sinh trưởng để nhân giống cần lưu ý, nếu dùng đỉnhsinh trưởng nhỏ quá thì nuôi cấy khó thành công, nếu dùng đỉnh sinhtrưởng lớn quá thì nuôi cấy dễ thành công nhưng cũng dễ bị nhiễm trùng.Kích thước của đỉnh sinh trưởng thay đổi tùy theo từng loài cây, tuy nhiênmột đỉnh sinh trưởng có kích thước 5-10 mm là thích hợp hơn cả. Con đường phát triển của đỉnh sinh trưởng để thành cây có thể trựctiếp hoặc thông qua giai đoạn protocorm (dẽ hành).II. Dụng cụ, thiết bị và hóa chất1. Dụng cụ - Bình tam giác (100 mL, 250 mL) - Giấy nhôm - Giấy thấm vô trùng - Lọ thủy tinh khử trùng mẫu vật nuôi cấy - Forceps, kéo, dao mổ - Đĩa petri vô trùng - Cốc chịu nhiệt, ống đong, micropipette các loại 169http://www.ebook.edu.vn2. Thiết bị - Nồi khử trùng - Tủ sấy - Laminar - Tủ lạnh - Microwave - Cân phân tích 10-4g - Cân kỹ thuật 10-2g - Máy cất nước 2 lần3. Hóa chất - Dung dịch stock môi trường MS (MS1, MS2, MS3, MS4 và MS5) - Dung dịch HgCl2 0,1% - Cồn 90% - Agar - Saccharose - Nước cất vô trùng - Dung dịch stock các chất kích thích sinh trưởng: BAP và NAA. - Nước dừaIII. Phương pháp tiến hành1. Nuôi cấy phát triển thành cây trực tiếp a. Nguyên liệu thực vật - Đỉnh sinh trưởng của cây hông (Paulownia fortunei) - Đỉnh sinh trưởng cây keo lai (Acasia hybrid) b. Môi trường nuôi cấy - MS đầy đủ - Saccharose 3% - Agar 0,8% - BAP 2 mg/L - NAA 1 mg/L 170http://www.ebook.edu.vn - pHmôi trường ∼ 5,8 c. Tiến hành Pha môi trường dinh dưỡng (1 L). Chia môi trường vào trong 20hoặc 40 bình tam giác loại 250 hoặc 100 mL, tương ứng. Nút miệng bìnhbằng giấy nhôm, sau đó đem khử trùng ở 121oC (1 atm)/15-30 phút (môitrường chuẩn bị trước từ 2 ngày trở lên). Rửa sạch đỉnh sinh trưởng bằng xà phòng dưới dòng nước chảy,cắt bỏ những lá chung quanh chỉ để lại một vài lá, cho vào lọ thủy tinh vôtrùng để chuẩn bị khử trùng mẫu vật. Trước khi cấy, laminar phải được bật đèn khử trùng 30 phút. Cácdụng cụ cần thiết cho quá trình cấy (forceps, kéo, dao, bình khử trùng,cồn, giấy thấm...) được đặt trong laminar trước khi bật đèn. Khử trùng sơ bộ bằng cồn 90% từ 30 giây đến 1 phút, sau đóbằng HgCl2 0,1 % trong 5 phút, cuối cùng rửa sạch HgCl2 bằng nước cấtvô trùng từ 4-5 lần (các thao tác này thực hiện trong laminar). Lấy mẫu vật ra thấm khô trên giấy thấm vô trùng bóc bỏ những láchung quanh, chỉ giữ lại đỉnh sinh trưởng (những phần mô thấm dung dịchkhử trùng cũng cần phải cắt bỏ). Sau đó, cấy mẫu vào các bình tam giácchứa môi trường dinh dưỡng đã được chuẩn bị sẵn. Các bình môi trườngđã cấy mẫu được đặt trong phòng nuôi với nhiệt độ 25 ± 2oC, thời gianchiếu sáng 8-10 giờ/ngày với cường độ 2000-3000 lux. Sau 3-4 tuần, đỉnh sinh trưởng sẽ phát triển thành cây nhờ quátrình kéo dài chồi (shoot elongation).2. Nuôi cấy phát triển cây thông qua giai đoạn protocorm a. Nguyên liệu thực vật - Đỉnh sinh trưởng hoặc chồi nách của hoa lan Dendrobium - Đỉnh sinh hoặc dứa (Ananas comusus) b. Môi trường nuôi cấy - Lan: MS đầy đủ Saccharose 2% Agar 0,8% Nước dừa 15% 171http://www.ebook.edu.vn NAA 0,1 mg/L BAP 1,0 mg/L pHmôi trường ∼ 5,8 - Dứa: MS đầy đủ Saccharose 2% Agar 0,8% NAA 0,5 mg/L BAP 0,2 mg/L pHmôi trường ∼ 5,8 c. Tiến hành Cá ...