Bài 2 - KỸ THUẬT PCR (Polymerase Chain Reaction)

Phương pháp PCR là phương pháp khuếch đại nhanh nhiều bản sao của các đoạn DNA mà không cần phải qua tạo dòng. Phương pháp này được K.Mullis đưa ra năm 1985 và Saiki hoàn thiện năm 1988.PCR là phản ứng nhân bản trình tự DNA quan tâm trong ống nghiệm. Phương pháp này được thực hiện in-vitro với sự hiện diện của enzyme DNA-polymerase. Sự khuếch đại được thực hiện nhờ các chu trình nhiệt được lặp lại. ...
Nội dung trích xuất từ tài liệu:
Bài 2 - KỸ THUẬT PCR (Polymerase Chain Reaction) BAØI 2 KỸ THUẬT PCR(Polymerase Chain Reaction)Phương pháp PCR là phương pháp khuếch đại nhanh nhiều bản sao của các đoạn DNA mà không cần phải qua tạo dòng. Phương pháp này được K.Mullis đưa ra năm 1985 và Saiki hoàn thiện năm 1988. I. NGUYÊN TẮC CỦA PHƯƠNG PHÁP PCR là phản ứng nhân bản trình tự DNA quan tâmtrong ống nghiệm. Phương pháp này được thực hiện in-vitro với sự hiện diện của enzyme DNA-polymerase. Sựkhuếch đại được thực hiện nhờ các chu trình nhiệt đượclặp lại. PCRII. CÁC THÀNH PHẦN CẦN THIẾT ĐỂ THỰCHIỆN PHẢN ỨNG Sîi khu«n (DNA hoÆc cDNA) C¸c måi (Oligonucleotide primers) DNA polymerase chÞu nhiÖt (Taq) dNTP’s Dung dÞch ®Öm Ion Mg++III. TIẾN HÀNH PHẢN ỨNG1. BiÕn tÝnh ADN: 94-95oC, 30-60 gi©y.2. B¾t cÆp cña måi vµo sîi khu«n: 45-60oC, 30-60 gi©y.3. Ph¶n øng kÐo dµi chuçi: 72oC, 60 gi©y/1kb. 3 bíc trªn h×nh thµnh 1 chu kú. Ph¶n øng PCR ®îc tiÕn hµnh trong kho¶ng 25-40 chu kú.Trong kü thuËt PCR th«ng thêng ngêi ta thùc hiÖn bíc biÕn tÝnh ADN tríc khi bíc vµo chu kú. Bíc nµy thêng ®îc thùc hiÖn ë 94-95oC, 2-3 phót. Ph¶n øng PCR - bíc b¾t cÆp cña c¸c måi vµo sîi khu«n 5’ 3’ 3’ 5’ 45 - 60ºC5’ 3’3’ 5’ Ph¶n øng PCR - bíc kÐo dµi chuçi 5’ 3’3’ 5’ 72ºC5’ 5’ 3’3’ 5’ 5’Ph¶n øng PCR - s¶n phÈm ®îc h×nh thµnh sau 3 bíc BiÕn tÝnh B¾t cÆp & kÐo dµi chuçi 5’ 5’ 5’ 5’ 5’ 5’ 5’ 5’S¶n phÈm cuèi cïng cña ph¶n øng PCRIV. LỢI ÍCH CỦA PHẢN ỨNG PCR Thời gian thực hiện rất nhanh. Chỉ cần khoảng 3 giờ để khuếch đại trình tự DNA trong khi với phương pháp tạo dòng ta mất khoảng 1 tuần; Đơn giản và ít tốn kém; Độ tinh sạch của mẫu không cần cao;V. CÁC ỨNG DỤNG CỦA KỸTHUẬT PCR1. Nhân phân tử RNA bằng kỹ thuật PCR Cần có các đoạn mồi kết hợp được với khuôn RNA, sau đó tổng hợp các phân tử DNA nhờ enzyme reverse trancriptase theo kỹ thuật PCR. Enzyme Tth DNA-polymerase có thể thực hiện cả phản ứng sao chép ngược và phản ứng tăng số lượng. Quá trình này cần có ion mangan.2. Kỹ thuật RAPD (Random AmplifiedPolymorphic DNA) Kỹthuật RAPD được thực hiện theo các bước sau: – Tách chiết DNA tổng số, nhân DNA bằng máy PCR; – Điện di trên gel; – Xác định tính đa dạng di truyền bằng các ph ần mềm thông dụng. Các số liệu thu được cho thấy sự gần gũi hoặc cách biệt di truyền của các mẫu nghiên cứu.VI. CÁC HẠN CHẾ CỦA PHƯƠNGPHÁP PCR1. Kích thước của trình tự cần khuếch đạiTrừ vài trường hợp rất cá biệt, phương pháp PCR không hoạt động được với những đoạn DNA lớn hơn 3kb. Việc sử dụng PCR đối với các độ dài dưới 1,5 kb cho kết quả tốt.2. Sự ngoại nhiễm.3. Các sai sót gây ra do Taq polymerase.Sự sao chép bởi Taq polymerase cho tỷ lệ sai khá cao (10-4)