Bài giảng Sinh học phân tử: Chương 8 - Nguyễn Hữu Trí

Bài giảng Sinh học phân tử - Chương 8 "Các kỹ thuật phân tích trong sinh học phân tử" trình bày những nội dung sau: Tách chiết DNA, tách chiết RNA, phương pháp sắc ký, các phương pháp định tính và định lượng thô nucleic acid, phương pháp điện di, phương pháp định lượng bằng quang phổ kế,... Mời các bạn tham khảo.
Nội dung trích xuất từ tài liệu:
Bài giảng Sinh học phân tử: Chương 8 - Nguyễn Hữu TríChương 8Các kỹ thuật phân tích trongSinh học phân tử24/03/2016 3:01 SA1Nguyễn Hữu TríTách chiết DNA•••••Để thu nhận DNA tinh sạch cần loại bỏ những thành phần tạp nhiễm,mà quan trọng nhất là protein.Sự tách chiết DNA dựa trên nguyên tắc hòa tan khác nhau của các phântử khác nhau (nucleic acid/protein) trong hai pha không hòa tan(phenol, chloroform/nước).Mục đích là thu được các phân tử nucleic acid ở trạng thái nguyên vẹntối đa, không bị phân hủy bởi các tác nhân cơ học hay hóa học.Các nucleic acid cần được tách chiết trong điều kiện nhiệt độ thấp để ứcchế hoạt động của các enzyme nội bào (DNase và RNase).Sau công đoạn tách chiết, nucleic acid tinh sạch nằm trong một thể tíchdung dịch lớn. Sự tủa kết hợp với ly tâm cho phép thu nhận nucleic aciddưới dạng cặn tủa dễ bảo quản và khi cần có thể hòa lại trong nước theonồng độ mong muốn.24/03/2016 3:01 SA2Nguyễn Hữu Trí1Tách chiết DNA• Bước 1: phá màng tế bào, màng nhân• Bước 2: loại protein• Bước 3: thu hồi nucleic acid24/03/2016 3:01 SA3Nguyễn Hữu TríTách chiết DNA•••Phá màng tế bào, màng nhân: nghiền tế bào, mô trong một hỗn hợp chất tẩy(SDS) và proteinase để phá vỡ màng tế bào, màng nhân, giải phóng DNA ramôi trường đồng thời phân hủy các protein liên kết với DNA.• Chất tẩy là phân tử lưỡng cực, sẽ kết hợp với protein màng và các phântử phospholipid làm phá vỡ cấu trúc màng.• Chất tẩy ion hóa có tác dụng phá màng mạnh, chất tẩy không ion hóa cótác dụng phá màng nhẹ hơn.Loại protein: lắc mẫu trong dung dịch phenol:chloroform để biến tínhprotein đồng thời không hòa tan nucleic acid. Protein bị biến tính không hòatan trong pha nước có chứa nucleic acid và sau khi li tâm sẽ tủa thành mộtlớp nằm giữa pha nước và pha phenol:chloroform. Thu hồi nucleic acidtrong pha nước.Tủa nucleic acid: nhằm thu nhận nucleic acid dưới dạng cô đặc để bảo vệchúng khỏi sự phân hủy của các enzyme và khi cần có thể hòa lại trongnước theo nồng độ mong muốn. Có thể tủa trong ethanol hoặc isopropanol.Sau đó li tâm để thu nhận lại nucleic acid. Cặn tủa được rửa trong ethanol70% để loại bỏ các muối hoặc các dấu vết của isopropanol.24/03/2016 3:01 SA4Nguyễn Hữu Trí2Tách chiết DNALy tâm phân đoạn (a)và phân đoạn vùng(b) phân tách cáctrình tự trong hỗnhợp dựa trên khốilượng của chúng.Thời gian và lực lytâm được xác địnhcho từng nhóm phầntử. Dung dịch ly tâmcó tỷ trọng thấp hơncác phần tử cần phântách.24/03/2016 3:01 SA5Nguyễn Hữu TríTách chiết DNALy tâm đẳng tỷ trọng (isopycnic) phân táchcác phần tử trong hỗn hợp dựa trên tỷtrọng của chúng. Thời gian và lực ly tâm làchung cho các nhóm phần tử. Dung dịchly tâm có tỷ trọng với giá trị đi từ thấp đếncao hơn tỷ trọng của các phần tử cầnphân tách.Ly tâm trên gradient liên tục CsCl: trongquá trình ly tâm, dung dịch CsCl sẽ tựđộng hình thành một gradient đẳng tỉtrọng với tỉ trọng tăng dần từ miệng ốngxuống đáy ống. Dưới tác động của lực lytâm, các nucleic acid di chuyển trong ốngvà đến vị trí có tỉ trọng bằng với tỉ trọngcủa chính nó sẽ ngừng lại và hình thànhmột lớp cố định trong ống. Lớp này đượcthu nhận lại sau ly tâm.24/03/2016 3:01 SA6Nguyễn Hữu Trí3RNA tổng số•Messenger RNA (mRNA): 1-5%Là mạch khuôn cho quá trình sinh tổng hợp protein• Ribosomal RNA (rRNA): >80%Thành phần cấu trúc nên ribosom• Transfer RNA (tRNA): 10-15%Vận chuyển acid amino tương ứng với codon trênmRNATách chiết RNA4Phương pháp sắc ký• Sắc ký ái lực: trên poly U-Sepharose hay oligodTcellulose, dùng để tinh sạch mRNA.• Sắc ký lọc gel dùng trong phân tách các nucleicacid và nucleotic tự do sau quá trình tạo mẫu dò(probe) đánh dấu.• Sắc ký trao đổi ion trên vi cột để thu hồi nhữnglượng rất nhỏ DNA.• Sắc ký lỏng hiệu suất cao: có độ phân giải rấtcao, được dùng trong tinh sạch cácoligonucleotide tổng hợp, plasmid, phân tách cácđoạn DNA.24/03/2016 3:01 SA9Nguyễn Hữu TríCác phương pháp định tính và địnhlượng thô nucleic acid• Điện di gel– Agarose– Polyacrylamide• Quang phổ kế: đo mật độ quang (OD – Optical density)24/03/2016 3:01 SA10Nguyễn Hữu Trí5 ...