Công nghệ sinh học_ Chương 1

Tài liệu tham khảo môn Công nghệ sinh học _ Chương " Các vector sử dụng trong công nghệ chuyển gen ở động vật và thực vật"
Nội dung trích xuất từ tài liệu:
Công nghệ sinh học_ Chương 1 1Chương 1 Các vector sử dụng trong công nghệ chuyển gen ở động vật và thực vậtI. Vector Trong sinh học, vector là một phân tử DNA có khả năng mangmột đoạn DNA ngoại lai và khi xâm nhập vào loại tế bào chủ thíchhợp thì có khả năng tự tái bản không phụ thuộc vào sự sao chép củahệ gen tế bào chủ. Nói cách khác, vector là một phương tiện truyền thông tin ditruyền trong cơ thể hoặc giữa các cơ thể khác nhau. Tế bào chủ thường được sử dụng là vi khuẩn E.coli. Phần lớncác vector là các phân tử DNA dạng vòng nhỏ (plasmid) hoặc làbacteriophage. Vector có thể được cắt ở một vị trí xác định bằng một enzymhạn chế và được nối với một đoạn DNA tương hợp khác được cắtbởi cùng enzym. Trong tạo dòng phân tử, vector là rất cần thiết bởi vì thực tếcho thấy rằng một đoạn DNA chứa gen không thể làm gì trong tếbào chủ. Vì nó không phải là một bộ phận của genome bình thườngcủa tế bào, cho nên nó sẽ không được tái bản khi tế bào phân chia,không được biểu hiện và có khả năng bị phân huỷ khá nhanh. Trong kỹ thuật di truyền, vector là công cụ có khả năng nghiêncứu genome người và genome các loài khác và sự sử dụng chúngtrong nghiên cứu đang trở nên ngày càng phổ biến một cách rộng rãi.II. Các đặc tính của vector - Vector phải đủ lớn để mang DNA ngoại lai nhưng không quálớn. - Vector phải chứa các trình tự kiểm soát (control sequences)như khởi điểm tái bản (origin of replication), promoter. 2 - Vector phải mang một hoặc nhiều vị trí nhận biết của enzymhạn chế. - Vector phải mang các gen marker chọn lọc (thường là các genkháng chất kháng sinh). Vì vậy các tế bào chứa chúng có thể đượcphát hiện một cách dễ dàng.III. Các bước trong tạo dòng phân tử - Nối vector và đoạn DNA ngoại lai cần được tạo dòng trongống nghiệm để tạo DNA tái tổ hợp nhờ sự xúc tác của enzym ligase. - Biến nạp DNA tái tổ hợp vào một dòng tế bào chủ. Chọn lọcthể biến nạp trên môi trường agar trong đĩa petri có chất kháng sinh. - Tách dòng DNA tái tổ hợp bằng cách sử dụng mẫu dò(probe).IV. Các vector sử dụng để chuyển gen ở động vật và thựcvật1. Các vector sử dụng để chuyển gen ở động vật1.1. Vector sử dụng để thêm gen Phần lớn các vector sử dụng hiện nay để tạo động vật chuyểngen bằng cách thêm gen được xây dựng để được hợp nhất vàogenome. Các phương pháp đang được sử dụng hoặc nghiên cứu đểtăng tần số hợp nhất của gen ngoại lai hoặc duy trì chúng như là cácnhiễm sắc thể nhỏ độc lập.1.1.1. Vector thẳng tối thiểu (Minimum linear vectors) Ở đại đa số trường hợp, các nhà nghiên cứu sử dụng các đoạngenome chứa một hoặc hai gen hay chuẩn bị các cấu trúc gen hoạtđộng chức năng từ các yếu tố khác nhau. Các đoạn của vector chứacác vùng phiên mã và điều hòa từ plasmid. Thực vậy, các vectorvòng hợp nhất với tần số thấp hơn nhiều so với các đoạn DNA thẳngvà trình tự plasmid thường phá hủy các gen chuyển đã liên kết. Ðiềunày đúng đối với các vector khác nhau như plasmid, cosmid, phage,BAC và YAC. Tuy nhiên một số nghiên cứu cho thấy rằng vectorBAC vòng hợp nhất vào genome với hiệu quả giống như bản saomạch thẳng của chúng. Nói cách khác, các vector mang các đoạn 3Hình 1.1: : Tạo dòng bằng vector plasmid 4DNA genome dài ít nhạy với hiệu quả câm của các trình tự củaprokaryote. Ðiều này là thích hợp nhất nhờ sự hiện diện của các yếutố cách ly ở các đoạn genome dài hoặc nhờ một hiệu quả khoảngcách đơn giản. Các đoạn DNA không chứa các trình tự đặc biệt hợp nhất vàogenome với tần số tương đối thấp. Một số DNA xen vào tạo ra sốđộng vật chuyển gen nhiều hơn so với các DNA khác. Ðiều này cóthể xuất hiện từ sự có mặt của các trình tự trong đoạn xen mà nhậnbiết thường xuyên các trình tự genome (Hình 1). Một số các đoạnxen vào có thể chứa các trình tự ưu tiên cho sự phiên mã của chúngvà sự duy trì của chúng trong phôi, tăng cường sự hợp nhất xảy ra.1.1.2. Vector chứa các trình tự lặp lại Cơ chế của sự hợp nhất được mô tả ở hình 1 bao hàm sự nhậnbiết giữa các trình tự của đoạn xen và của genome. Tần số của sựhợp nhất được tăng lên nhờ sự có mặt ở cả hai đầu của các đoạn xencác trình tự lặp lại cao trong genome chủ ngay cả khi chúng bị thoáihóa nhiều hoặc ít. Ở bò, một trình tự có mặt nhiều ở tâm động làmtăng thêm các đoạn xen đã tăng tần số hợp nhất. Ở trường hợp đặcbiệt này, các gen chuyển vẫn không hoạt động. Ðiều này là do tâmđộng là vùng không phiên mã của genome phá hủy gen chuyển. Một phương pháp tương tự đã được tiến hành ở chuột, sửdụng các trình tự Alu. Các trình tự này là các yếu tố lặp lại. Các trìnhtự Alu chứa 200-300 nucleotid là có nhiều trong genome động vật cóvú và đặc biệt là ở các vùng lân cận hoặc ở trong các vùng phiên mã.Một số trình tự Alu được phiên mã bởi RNA polymerase III, làm chochức năng của RNA không rõ ràng và có thể không tồn tại. Các thínghiệm đã cho thấy rằng tần số hợp nhất được tăng lên đối với cácđoạn xen chứa trình tự Alu.1.1.3. Vector transposon Transposonlà một đoạn DNA có khả năng tự tái bản một cáchđộc lập và xen vào một vị trí mới trong cùng nhiễm sắc thể hoặc mộtnhiễm sắc thể khác (Hình 1.2). Với tiến bộ của kỹ thuật di truyềntransposonđã được sửa đổi, thiết kế thành các công cụ di truyền vớimục đích đặc biệt. 5 Hình 1.2: Cấu trúc của transposon Kích thước của transposon nói chung là không dài hơn 2kb.Nhiều bản sao của transposon có mặt trong genome tại các vị tríngẫu nhiên một cách rõ ràng. Transposon được phiên mã thànhRNA, RNA được phiên mã ngược thành DNA sợi kép. DNA sợi képnày hợp nhất vào genome với hiệu quả ...