Đặc điểm di truyền phân tử của vi khuẩn Orientia tsutsugamushi gây bệnh sốt mò ở một số tỉnh phía Bắc

Đặc điểm di truyền phân tử của vi khuẩn Orientia tsutsugamushi gây bệnh sốt mò ở một số tỉnh phía Bắc
Nội dung trích xuất từ tài liệu:
Đặc điểm di truyền phân tử của vi khuẩn Orientia tsutsugamushi gây bệnh sốt mò ở một số tỉnh phía BắcNghiên cứu khoa học công nghệ ĐẶC ĐIỂM DI TRUYỀN PHÂN TỬ CỦA VI KHUẨN ORIENTIATSUTSUGAMUSHI GÂY BỆNH SỐT MÒ Ở MỘT SỐ TỈNH PHÍA BẮC (1) (2) (1) NGUYỄN VĂN MINH , NGUYỄN VĂN TÌNH , PHẠM THỊ HÀ GIANG , (3) (4) (1) TRỊNH VĂN TOÀN , DƯƠNG TUẤN LINH , VÕ VIẾT CƯỜNG 1. ĐẶT VẤN ĐỀ Orientia tsutsugamushi gây bệnh sốt mò (Scrub typhus) là vi khuẩn Gram âm,ký sinh nội bào bắt buộc. Bệnh được truyền từ động vật sang người thông qua vếtđốt của ấu trùng mò mang mầm bệnh và lưu hành phổ biến ở châu Á, từ Nhật Bản,Hàn Quốc, Nam Á, Pakistan, Ấn Độ đến các nước Á Rập và Thổ Nhĩ Kỳ [8]. Ở ViệtNam, bệnh sốt mò đã được phát hiện ở Sài Gòn từ năm 1915 bởi Goutron. Bệnhthường xuất hiện ở vùng trung du và miền núi, gần đây, bệnh xuất hiện rải rác ởnhiều khu vực và có xu hướng ngày càng tăng. Năm 2000÷2002, tại bệnh viện UôngBí (Quảng Ninh) có 449 bệnh nhân sốt mò vào điều trị. Bệnh nhân sốt mò được pháthiện rải rác quanh năm, nhưng có tỷ lệ cao từ tháng 5÷10 [3]. Trong thời gian từ2001÷2003, có 251 ca sốt mò được xác định bằng chẩn đoán huyết thanh học tạiBệnh viện Bạch Mai [6]. Tại tỉnh Yên Bái, từ tháng 4/2014 đến tháng 9/2014 đã có78 bệnh nhân bị bệnh sốt mò và 2 trường hợp tử vong [1]. Nguyên nhân gây bệnh và bùng phát dịch sốt mò phụ thuộc rất nhiều vào đặcđiểm của chủng lưu hành tại khu vực. Dựa vào sự khác biệt về cấu trúc khángnguyên bề mặt có trọng lượng phân tử 56-kDa của O. tsutsugamushi để phân loạigenotypes: Gilliam, Kato, Karp, TA763, Boryong, Kawasaki… [8]. Mục đích củanghiên cứu này nhằm phát hiện O. tsutsugamushi trong mẫu máu bệnh nhân nghingờ và xác định sự phân bố genotypes của O. tsutsugamushi lưu hành ở một số khuvực miền bắc Việt Nam. 2. ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1 Đối tượng và vật liệu Mẫu máu tổng số của 149 bệnh nhân được chẩn đoán lâm sàng nhiễm O.tsutsugamushi với các triệu chứng sau: - Khởi phát đột ngột, sốt cao 38÷40°C, nhức đầu, đau cơ; - Có hoặc không có vết loét đặc trưng; - Có thể nổi hạch sưng đau tại khu vực có vết loét. Mẫu bệnh phẩm được thu thập tại Bệnh viện Quân y 105, Hà Nội (BVQY105), Bệnh viện đa khoa Nghĩa Lộ, Yên Bái (BVĐK Nghĩa Lộ), Bệnh viện đa khoaHà Giang (BVĐK Hà Giang), từ tháng 8 năm 2016 đến tháng 8 năm 2017. Thu thậpcác thông tin ca bệnh bằng phiếu điều tra, lấy 2÷3 ml máu toàn phần có chống đôngbằng EDTA trong vòng 2 tuần kể từ ngày khởi bệnh. Kit QIAamp DNA mini kit (QIAgen - 51306), Phusion® Hot Start Flex 2XMaster Mix (NEB- M0536S) và các hóa chất khác đạt chuẩn sinh học phân tử.Tạp chí Khoa học và Công nghệ nhiệt đới, Số 13, 11 - 2017 59 Nghiên cứu khoa học công nghệ Trình tự các cặp mồi được thiết kế trên trình tự gen mã hóa kháng nguyênmàng 56-kDa với PCR 2 vòng (1st-2nd), sản phẩm PCR có kích thước 483 bp [5]. 2.2. Phương pháp và kỹ thuật 2.2.1. Phương pháp nghiên cứu Mô tả cắt ngang kết hợp với thực nghiệm trong phòng thí nghiệm. 2.2.2. Kỹ thuật nested PCR phát hiện O. tsutsugamushi ADN tổng số từ mẫu máu toàn phần bệnh nhân nghi ngờ sốt mò được táchbằng bộ kít QIAgen - 51306, tiến hành khuếch đại đoạn gen có kích thước 483 bpmã hóa cho kháng nguyên 56-kDa bằng kỹ thuật nested PCR [5]. 5 μl ADN tổng sốđược dùng làm khuôn để tiến hành PCR vòng 1 với cặp mồi P34 (5’-ATT GCTAGT GCA ATG TCT GC-3’)và P55 (5’-CTG CTG CTG TGC TTG CTG CG-3’)cho tổng số 25 μl phản ứng. Phản ứng được biến tính ở 94oC trong 3 phút; tiếp theolà 30 chu kỳ phản ứng của 94oC trong 20 giây, 61oC trong 30 giây, 72oC trong 2phút, phản ứng được kết thúc với chu kỳ kéo dài chuỗi ở 72oC trong 10 phút. 2,5 μlsản phẩm PCR của vòng 1 được sử dụng làm khuôn cho PCR vòng 2 với cặp mồiP10 (5’- CCT CAG CCT ACT ATA ATG CC-3’) và P11 (5’-CGA CAG ATG CACTAT TAG GC-3’) cho tổng số 25 μl phản ứng. Hỗn hợp phản ứng được biến tính ở94oC trong 3 phút; tiếp theo là 30 chu kỳ phản ứng của 94oC trong 20 giây, 61oCtrong 30 giây, 72oC trong 40 giây, phản ứng được kết thúc với chu kỳ kéo dài chuỗiở 72oC trong 5 phút. 2.2.3. Kỹ thuật giải trình tự gen 20 μl sản phẩm PCR được tinh sạch bằng kit QIAquick PCR Purification Kit(QIAgen, Đức) và sử dụng cặp mồi P10 và P11 để giải trình tự trên máy phân tíchphân đoạn DNA tự động 3500 (Applied Biosystems) và kit BigDye® Terminatorv3.1 cycle sequencing (Applied Biosystems). 2.2.4. Phân tích trình tự gen Hiệu chuẩn các trình bằng phầm mềm Bioedit, xếp gióng cột (align) và dựngcây phát sinh chủng loại bằng phần mềm MEGA7. 3. KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN 3.1. Phát hiện O. tsutsugamushi bằng kỹ thuật nested PCR Kết quả nested PCR đã phát hiện 47/149 mẫu máu dương tính với O.tsutsugamushi, chiếm 31,5%. Hiện nay, việc chẩn đoán Rickettsia nói chung và bệnhsốt mò nói riêng chủ yếu dựa vào đặc điểm lâm sàng. Xét nghiệm cận lâm sàng nhưphát hiện IgM kháng O. tsutsugamushi hoặc PCR được sử dụng trong chẩn đoán xácđịnh bệnh sốt mò ở một số nước [9,17]. Hai loại mẫu bệnh phẩm chủ yếu được sửdụng trong xét nghiệm PCR là vảy hoặc dịch vết loét và máu toàn phần, kết quả xétnghiệm từ mẫu vảy vết loét thường có độ nhạy cao hơn so với mẫu máu [14].Nghiên cứu của Nguyễn Lê Khánh Hằng cho thấy tỷ lệ dương tính với O.tsutsugamushi từ mẫu máu bệnh nhân nghi nhiễm sốt mò từ 48,5% đến 67% [2,12].60 Tạp chí Khoa học và Công nghệ nhiệt đới, Số 13, 11 - 2017Nghiên cứu khoa học công nghệTỷ lệ dương tính với O. tsutsugamushi trong các mẫu vảy vết loét và mẫu máu thuthập tại Bệnh viện Đa khoa Quảng Nam lần lượt là 85% và 25% [13]. Kết quảnghiên cứu của một số tác giả khác cho thấy độ nhạy của xét nghiệm PCR trên ...