Giáo trình -công nghệ di truyền - chương 8

Chương 8CHƯƠNG 8: PHƯƠNG PHÁP THU NHẬN CLONE TỪ GENE ÐẶC TRƯNGVấn đề được quan tâm hiện nay là làm cách nào để tạo phân tử DNA tái tổ hợp và chuyển chúng vào tế bào sống trong thực tiễn nhằm tạo các gen clone chuyên biệt và cung cấp thông tin quan trọng đối với SHPT và CNSH.. Kiểm tra thử nghiệm gene cloning – thông qua các kỹ thuật có thể chọn lọc trực tiếp những clone mang gene mong muốn hoặc phân biệt chúng với những thể tái tổ hợp khác mà quyết định sự thành công...
Nội dung trích xuất từ tài liệu:
Giáo trình -công nghệ di truyền - chương 8Chương 8 CHƯƠNG 8: PHƯƠNG PHÁP THU NHẬN CLONE TỪ GENE ÐẶC TRƯNG Vấn đề được quan tâm hiện nay là làm cách nào để tạo phân tử DNA tái tổhợp và chuyển chúng vào tế bào sống trong thực tiễn nhằm tạo các gen clonechuyên biệt và cung cấp thông tin quan trọng đối với SHPT và CNSH.. Kiểm tra thử nghiệm gene cloning – thông qua các kỹ thuật có thể chọn lọctrực tiếp những clone mang gene mong muốn hoặc phân biệt chúng với những thểtái tổ hợp khác mà quyết định sự thành công hay thất bại.8.1 VẤN ĐỀ CHỌN LỌC: Ngay cả những vi sinh vật đơn giản nhất như E.Coli cũng chứa đến hàngngàn gen và việc phân cắt giới hạn tổng số DNA tế bào tạo ra không chỉ nhữngđoạn mang gen mong muốn mà còn tạo ra các đoạn chứa các gen còn lại.(H8.1a)Trong suốt phản ứng gắn kết sẽ tạo ra nhiều phân tử DNA tái tổ hợp khác nhau dokhông có chọn lọc đối với từng đoạn rieng rẻ (H8.1b). Do đó mà có nhiều clone táitổ hợp được tạo ra sau quá trình biến nạp và plating out ( trải trên đĩa) (H8.1c).Bằng cách nào đó mà xác định clone mong muốn.Hình 8.1: Vấn đề chọn lọca. Cắt phân tử DNA bằng enzyme cắt giới hạn EcoRI, rồi chuyển vào vector.b. Kết quả tạo phân tử DNA tái tổ hợp.c. Tất cả đều tạo khuẩn lạc, làm thế nào xác định clone mong muốn.8.1.1 Hai kỹ thuật cơ bản để tạo clone mong muốn:  Chọn lọc trực tiếp từ gen mong muốn (H8.2a): chỉ những clone từ các genmong muốn là được tạo ra. Hầu như sự chọn lọc được tiến hành trên đĩa.  Xác định clone từ gen library (H8.2b) :đòi hỏi thử nghiệm ‘shotgun’ cloningban đầu để tạo clone library chứa hầu hết hoặc tất cả các gen có trong tế bào, sauđó phân tích từng clone riêng rẻ để xác định clone mong muốn.Hình 8.2: Hai kỹ thuật cơ bản xác định clone chuyên biệta. Chọn lọc trực tiếp: chỉ thể tái tổ hợp mong muốn mới có thể sống sót.b. Xác định thể tái tổ hợp mong nuốn từ một clone library 1Chương 8 Trong các trường hợp tổng quát, th ường sử dụng phương pháp chọn lọc trựctiếp do nhanh, rõ ràng nhưng không phải thích hợp cho tất cả các gen. Vì thế kỹthuật xác định clone là rất quan trọng.8.2 CHỌN LỌC TRỰC TIẾP: Điều cần thiết để có một cloned gen là plate (trải trên đĩa) những sản phẩmđã được biến đổi trên môi trường agar – môi trường chỉ cho phép những thể tái tổhợp phát triển. Do đó chỉ những khuẩn lạc thu có các tế bào chứa phân tủ DNA táitổ hợp. Ví dụ: chọn gen mong muốn có tính kháng chuyên biệt đối với kháng sinh.Cloned gene kháng kanamycin của plasmid R6-5( thật ra plasmid này mang genkháng đến 4 loại khánh sinh: Kanamycin, Chloramphenicol, Streptomycin vàSulphonamide). Dùng E.CoRI cắt DNA plasmid tạo 13 đoạn gen và gen khángKanamycin nằm ở 1 trong 13 đoạn này (H8.3a). Để clone gen này, các đoạn thuđược sau khi cắt bằng E.CoRI sẽ được chèn vào vị trí cắt của E.CoRI của vectorpBR322. Hỗn hợp nối kết gồm nhiều bản sao của 13 phân tử DNA tái tổ hợp, trongđó có gen kháng Kanamycin.(H8.3b) Những đoạn không có tính chèn sẽ ko được dùng để chọn lọc thể tái tổ hợpkhi vị trí cắt của E.CoRI trên pBR322 được tạo ra. Điều này là do vị trí cắt khôngnằm trên gen kháng Ampicilin hoặc tetracylin ở plasmid này (H6.1).Điều này lạikhông quan trọng đối với việc clon gen kháng kanamycin do ở đây gen cần clonđược sử dụng như 1 marker chọn lọc.Các sản phẩm biến nạp được trải trên đĩathạch có chứa kanamycin, ở đó chỉ có thể tái tổ hợp chứa gen kháng kanamycinmới có khả năng sống sót và tạo ra khuẩn lạc (H8.3c).Hình 8.3:Chọn lọc trực tiếp clone gen kháng kanamycin của plasmid R6-5a. Plasmid R6-5 bị phận cắt thành 13 đoạn khác nhau bởi EcoRIb. Gắn kết 13 đoạn gen này vào vector tạo 13 phân tử DNA tái tổ hợp khác nhau,trải trên đĩa (plate out)c. Chỉ có một thể tái tổ hợp mọc được trên môi trường agar chứa kanamycin(50µg/ml), đó là thể chứa gen kháng kanamycina.Marker rescue mở rộng phạm vi chọn lọc trực tiếp: 2 Chương 8 Hạn chế của chọn lọc trực tiếp là chỉ dùng để clone các gen kháng kháng sinh. Hiện nay người ta sử dụng các dòng đột biến từ E.Coli làm vật chủ cho sự biến nạp được ứng dụng rộng rãi trong các kỹ thuật. Ví dụ: clone gen trpA từ E.coli – gen này mã hóa cho enzyme tổng hợp tryptophan (một loại aa thiết yếu). Dòng E.coli đột biến chứa gen không có chức năng trpA- chỉ sống sống trong mối trường tăng sinh có tryptophan. Và dòng E.coli trpA- là ví dụ về sự khuyết dưỡng. Dòng E.coli trpA- dùng để clone các bản sao của gen trpA: tinh sạch toàn bộ DNA từ dòng wilde-type không bị đột biến. Cắt DNA bằng enzyme endonuclease giới hạn, tiếp theo gắn kết vào một vector, tạo nhiều phân tử DNA tái tổ hợp trong đó có thể tái tổ hợp mang bản sao của gen trpA (H8.4a). Ngày nay hỗn hợp gắn kết được sử dụng để biến nạp vào các tế bào E.coli - ...