Hóa Enzyme - Phân Tích Phân Tử Enzyme Phần 3

Chiết rút enzyme Muốn tìm hiểu toàn bộ hoạt động sống của cơ thể sinh vật, chúng ta phải biết bản chất của những biến đổi hóa học xảy ra trong từng mô tế bào.
Nội dung trích xuất từ tài liệu:
Hóa Enzyme - Phân Tích Phân Tử Enzyme Phần 3 26thể được các sinh vật tiết ra môi trường sống. Đó là các enzyme ngoài tếbào (extracellular). Enzyme vi sinh vật thường chiết là enzyme ngoại bào. 272.2.2. Chiết rút enzyme Muốn tìm hiểu toàn bộ hoạt động sống của cơ thể sinh vật, chúngta phải biết bản chất của những biến đổi hóa học xảy ra trong từng mô tếbào. Điều đó chỉ thực hiện được khi chúng ta tách được các tế bào ra khỏicác mô và chiết rút cũng như làm sạch các enzyme chứa trong chúng. Từcác dạng enzyme tinh khiết thu được chúng ta có thể nghiên cứu sâu sắccơ chế tác dụng, tính đặc hiệu trong hoạt động xúc tác của chúng. Tùytheo những đặc tính riêng biệt của từng loại enzyme mà lựa chọn phươngpháp làm sạch cho thích hợp. Trong quá trình tinh chế enzyme, mặc dầutrình tự và các thủ thuật ở các bước có thể thay đổi , song vẫn có nhữngnguyên tắc chung. Như chúng ta đã biết, trong cơ thể sinh vật, enzyme có trong tếbào chất và các cấu tử (nhân, microsome, ty thể, lysosome...) của tế bào.Tế bào được bao bọc bằng một lớp màng. Lớp màng này ở vi khuẩn đôikhi rất bền và dày. Người ta còn thấy nhiều enzyme liên kết rất chặt chẽvới các cấu tử của tế bào. Các phân tử enzyme không có khả năng đi qua màng của tế bào vàmàng của các cấu tử của tế bào. Do đó để có thể chiết rút các enzyme nộibào, bước đầu tiên là phải phá vỡ cấu trúc của các tế bào có chứa enzymevà chuyển chúng vào dung dịch. Có thể phá vỡ cấu trúc của các tế bào bằng các biện pháp cơ họcnhư nghiền với bột thủy tinh hoặc cát thạch anh, làm đồng hóa bằng thiếtbị đồng hóa (homogenizator). Thiết bị có chày thủy tinh gắn với một môtơquay và có thể điều chỉnh được tốc độ quay theo yêu cầu. Các tế bào giữachày thủy tinh và thành cối sẽ bị phá hủy. Để việc phá vỡ có hiệu quả ởmô thực vật, trước khi nghiền người ta thường thái nhỏ mẫu để vào ngănđá hoặc cho trương nước (ví dụ như đối với mẫu hạt khô). Còn ở các môcủa động vật như gan hoặc thận, khi chiết enzyme người ta cần cắt bỏ cácmô liên kết. Muốn tách được các enzyme trong các cấu tử của tế bào, người tacòn phải dùng các yếu tố vật lý và hóa học khác nhau như sóng siêu âm,dùng các dung môi hữu cơ như butanol, aceton, glycerin, ethyl acetate...và chất detergent. Các hóa chất có tác dụng tốt cho việc phá vỡ các cấu tửcủa tế bào vì trong các cơ quan này thường chứa mỡ. Sau khi đã phá vỡ các cấu trúc của tế bào, enzyme được chiếtbằng nước cất, bằng các dung dịch đệm thích hợp hoặc các dung dịchmuối trung tính. 28 Có một số yếu tố ảnh hưởng đến quá trình chiết rút cần lưu ý.Trước hết đó là nhiệt độ. Để tránh mất hoạt tính hoặc thậm chí vô hoạt,cần chiết rút và tiến hành kết tủa enzyme ở nhiệt độ thấp (từ 3 đến 5 0C).Các thao tác phải nhanh. Một số chất điện ly làm tăng quá trình chiết rútenzyme như NaCl, ZnCl2, CaCl2. Tác dụng của chúng còn phụ thuộc vàophương pháp dùng khi chiết rút. Ví dụ như nếu dùng máy nung thì cả bachất trên đều có tác dụng. Nếu chỉ để lắng thì chỉ NaCl có tác dụng. Vìvậy cần dùng chất điện ly thích hợp. Ví dụ khi chiết rút amylase, nếu chothêm NaCl 0,1 - 0,2 % vào dung dịch chiết rút thì hiệu suất chiết rút tănglên 30%. Người ta còn nhận thấy, nếu thêm vào dịch chiết CaCl2 0,2% sẽlàm cho kết tủa enzyme tốt hơn và cấu trúc của kết tủa cũng tốt hơn. Trong quá trình chiết rút enzyme ở các đối tượng động, thực vật,có trường hợp còn có mặt chất màu làm ảnh hưởng đến việc làm sạch hoặcxác định hoạt độ enzyme. Trong trường hợp này người ta còn cho thêmvào chất khử để loại màu. Màu của hemoglobin ở hồng cầu hoặc củachlorophyll và một số chất màu khác ở lá có thể bị loại trừ bởi hỗn hợpethanol, chloroform với tỷ lệ thích hợp. Hoạt độ enzyme superoxidedismutase (SOD) - một enzyme chống ôxy hóa có thể xác định sau khi đãloại màu khỏi dịch chiết enzyme. Ở các mẫu từ động vật có sắc tố melaninmàu nâu. Người ta thường loại màu trên cột nhựa trao đổi ion bằng cáchcho dịch enzyme qua cột hoặc lắc. Khi qua cột, chất màu bị giữ lại vàenzyme không bị giữ. Ví dụ người ta hay dùng DEAE - cellulose(Diethylamino ethyl - cellulose) hoặc than hoạt tính. Trong quá trình nàyphải chú ý kiểm tra pH. Sau khi loại màu cần kiểm tra lại hoạt độ củaenzyme. Trong dịch chiết, ngoài enzyme còn có các protein cấu trúc, cácchất cao phân tử khác nhau như polysaccharid nucleic acid, các chất cóphân tử nhỏ như đường monose, các chất lipid, muối khoáng...Để loạichúng phải sử dụng phối hợp nhiều biện pháp khác nhau. Để loại bỏ muối khoáng và các loại đường... là các tạp chất cóphân tử lượng thấp, người ta thường dùng phương pháp thẩm tích(dialysis) đối nước hay đối các dung dịch đệm loãng hoặc bằng cách lọcqua gel sephadex. Cách làm thẩm tích như sau: cho dung dịch enzyme vàotúi colodion hoặc cellophane (thông thường người ta dùng cellophane tốthơn), sau đó đặt cả túi vào nước cất hoặc dung dịch đệm pha loãng (nhưđệm phosphate có pH = 7, nồng độ 0,01M chẳng hạn). Màng cellophane làmàng bán thấm, có kích thước lỗ cho các chất có phân tử nhỏ xuyên và điqua vào các dung dịch đệm loãng theo định luật khuếch tán. Còn lại trongmàng là các chất protein có phân tử lớn. (Hình 2.1) 29 Hình 2.1. Thẩm tích để loại muối (NH4)2SO4 trong kết tủa protein Để loại bỏ các protein tạp (protein cấu trúc, protein trơ) và các chấtcó phân tử lượng cao khác người ta hay dùng kết hợp các phương phápkhác nhau: phương pháp biến tích chọn lọc nhờ tác dụng của nhiệt độ hoặcpH của môi trường, phương pháp kết tủa phân đoạn bằng muối trung tínhhoặc các dung môi hữu cơ, các phương pháp sắc ký (sắc ký hấp phụ, sắcký trao đổi ion), điện di, phương pháp l ...