Luận văn : HOÀN THIỆN QUY TRÌNH BIẾN NẠP ĐOẠN DNA VÀO TẾ BÀO VI KHUẨN E. coli DH5α part 3

3.4.8 Thiết lập phản ứng tạo blunt-end cho sản phẩm PCR Theo nguyên tắc của phản ứng PCR, sau khi kéo dài mạch đơn DNA, enzym Taq polynerase sẽ gắn thêm vào cuối trình tự DNA đơn một hoặc nhiều phân tử Adenin (polyA) để ổn định trình tự DNA, do đó sau khi phản ứng PCR xảy ra chúng ta sẽ thu được sản phẩm là những đoạn DNA đầu dính. Do điều kiện của thí nghiệm phải thiết lập phản ứng nối đầu bằng giữa plasmid và đoạn DNA từ sản phẩm PCR, chúng tôi tiến hành thiết...
Nội dung trích xuất từ tài liệu:
Luận văn : HOÀN THIỆN QUY TRÌNH BIẾN NẠP ĐOẠN DNA VÀO TẾ BÀO VI KHUẨN E. coli DH5α part 3 35 3.4.8 Thiết lập phản ứng tạo blunt-end cho sản phẩm PCR Theo nguyên tắc của phản ứng PCR, sau khi kéo dài mạch đơn DNA, enzymTaq polynerase sẽ gắn thêm vào cuối trình tự DNA đơn một hoặc nhiều phân tửAdenin (polyA) để ổn định trình tự DNA, do đó sau khi phản ứng PCR xảy ra chúng tasẽ thu được sản phẩm là những đoạn DNA đầu dính. Do điều kiện của thí nghiệm phảithiết lập phản ứng nối đầu bằng giữa plasmid và đoạn DNA từ sản phẩm PCR, chúngtôi tiến hành thiết lập phản ứng tạo đầu bằng cho đoạn DNA với enzym DNApolymerase I large fragment (Klenow). Phản ứng tạo đầu bằng Đầu bằng Đầu dính Hình 3.1 Phản ứng tạo đầu bằng (blunt-end) cho đoạn DNA Thiết lập phản ứng phủ đầu với các thành phần như sau: 2µl NEbuffer 10X DNA từ phản ứng PCR 6µl (1µg) dNTPs (33µmol) 1µl 1 unit (1µl) DNA fragment Klenow Thêm nước cho tới 20µl Ủ phản ứng ở 250C trong 15 phút, sau đó ngừng phản ứng bằng cách thêmEDTA đến nồng độ 10mmol và ủ ở 750C trong 20phút. Thiết lập phản ứng phủ đầu bằng cho plasmid Plasmid sau khi cắt bằng HindIII, và thực hiện phản ứng phủ đầu bằng theo quitrình sau: 2µl NEbuffer 10X 6µl (1µg) DNA plasmid dNTPs (33µmol) 1µl 36 1 unit (1µl) DNA fragment Klenow Thêm nước cho tới 20µl Ủ phản ứng ở 250C trong 15 phút, sau đó ngừng phản ứng bằng cách thêmEDTA đến nồng độ 10mmol và ủ ở 750C trong 20phút 3.4.9 Thiết lập phản ứng nối giữa plasmid và đoạn DNA đầu bằng (phản ứngnối blunt-end) T4 DNA ligase không giống như E. coli DNA ligase, nó có thể xúc tác phảnứng nối những đoạn DNA đầu bằng (Sgaramella và Khorana 1972, Sgaramella vàEhrlych 1978). Tuy nhiên phản ứng gắn kết sẽ không có được hiệu suất cao và cầnphải có các yếu tố sau: Nồng độ ATP thấp (0.5mM), (Ferretti và Sgaramella 1981),nồng độ enzym ligase cao (50unit/ml), lượng DNA insert và vector cao, tỉ lệ về số molcủa vector và đoạn DNA insert khoảng 1: 3-10. Trong phản ứng nối blunt-end có thể thêm vào các chất có phân tử lượng cao nhưPEG hay Hexamminecobalt chloride. Các chất này có vai trò làm tăng tốc độ phản ứngligation từ 1-3 lần, điều đó cho phép lượng DNA và nồng độ ligase giảm xuống vàkhông ngừng sắp xếp sản phẩm nối, sự nối bên ngoài phân tử được ngăn chặn, khi đóchỉ có phản ứng nối giữa vector-DNA insert và phản ứng nối giữa vector-vector xảy ra. Từ lượng của vector DNA tính ra lượng của DNA chèn Tỉ lệ DNA chèn (bp) Vector (ng) x DNA chèn (kb)(ng)DNA chèn = X Vector (kb) Vector Căn cứ vào tỉ lệ về số mol giữa vector và DNA chèn rồi dựa vào đó để tính ralượng DNA cần sử dụng Thực hiện phản ứng nối với các thành phần như sau: 1µl T4 reaction buffer DNA từ sản phẩm PCR 2µl (100ng) 1µl (50ng) DNA plasmid T4 ligase 1 unit Thêm nước cho tới 10µl Ủ phản ứng ở 160C qua đêm, tinh sạch trực tiếp sản phẩm bằng cách sử dụngcột tinh sạch GFX thu lại bằng 3μl elution buffer. 37 3.4.10 Chuyển sản phẩm nối vào tế bào vi khuẩn E. coli DH5α khả nạp (theoquy trình của Sambrook và cộng sự, 1989 có chỉnh sửa) Thực hiện biến nạp theo quy trình sau: - Hút 10µl dịch huyền phù tế bào competent cell đã được chuẩn bị cho vào eppendorf 1.5 ml, thêm 3µl DNA plasmid tái tổ hợp vào, đảo nhẹ, giữ lạnh trong đá trong 20 phút. - Chuyển nhanh eppendorf trên vào bồn nhiệt 420C, giữ trong 90 giây. - Chuyển nhanh eppendorf trên vào bình nước đá, giữ trong 2 phút. - Thêm 200µl môi trường LB lỏng vào eppendorf và ủ ở 370C trong 1 giờ. - Hút 200µl dịch vi khuẩn đã biến nạp cho lên đĩa môi trường LB có chứa kháng sinh ampicilin nồng độ 100μg/ml, X-gal, IPTG, dùng que trang trang đều trên bề mặt môi trường. - Để đĩa ở nhiệt độ phòng cho đến khi khô bề mặt. - Lật ngược đĩa, ủ qua đêm ở 370 C (khoảng 14 - 16 giờ). - Quan sát khuẩn lạc trên đĩa petri, bắt những khuẩn lạc trắng cấy sang môi trường LB lỏng có kháng sinh Ampicillin (60µg/ml) trong 16-18 giờ. Thực hiện biến nạp theo quy trình trên plasmid chưa tái tổ hợp để làm đốichứng. Bắt những khuẩn lạc xanh cấy sang môi trường LB lỏng có kháng sinhAmpicillin (60µg/ml) trong 16-18 giờ. Thực hiện tách chiết plasmid theo qui trình ở mục 3.4.6.1. 38 PHẦN 4. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN4.1 Các quy trình biến nạp plasmid vào tế bào vi khuẩn B A C Hình 4.1 Biến nạp plasmid vào tế bào vi khuẩn ở thể tích 10:1.5 (A) Biến nạp với tỷ lệ tế bào khả nạp và plasmid theo thể tích (µl) là 10:1.5 phục hồi trong 500µl môi trường LB lỏng trong 1h, cấy 100µl dịch phục hồi lên đĩa môi trường ...