Luận văn : NGHIÊN CỨU ĐÁP ỨNG MIỄN DỊCH ĐỐI VỚI PROTEIN TÁI TỔ HỢP MBP-VT2eB TRÊN THỎ part 4

17 2.6.2. Phản ứng kết tủa khuếch tán kép trên thạch (Double diffusion in two dimensions) (Kỹ thuật Ouchterlony) [6] Phương pháp thường được sử dụng để đánh giá tính đặc hiệu của kháng thể đối với kháng nguyên là phản ứng kết tủa khuếch tán kép trên thạch (kỹ thuật Ouchterlony). Kỹ thuật này dựa trên sự hình thành cấu trúc mạng lưới của agarose. Các phân tử có trọng lượng nhỏ hơn 200 kDa khuếch tán dễ dàng trong agarose, các phân tử có trọng lượng lớn di chuyển chậm và khó khăn hơn ...
Nội dung trích xuất từ tài liệu:
Luận văn : NGHIÊN CỨU ĐÁP ỨNG MIỄN DỊCH ĐỐI VỚI PROTEIN TÁI TỔ HỢP MBP-VT2eB TRÊN THỎ part 4 17 2.6.2. Phản ứng kết tủa khuếch tán kép trên thạch (Double diffusion in two dimensions) (Kỹ thuật Ouchterlony) [6] Phương pháp thường được sử dụng để đánh giá tính đặc hiệu của kháng thể đốivới kháng nguyên là phản ứng kết tủa khuếch tán kép trên thạch (kỹ thuậtOuchterlony). Kỹ thuật này dựa trên sự hình thành cấu trúc mạng lưới của agarose. Các phântử có trọng lượng nhỏ hơn 200 kDa khuếch tán dễ dàng trong agarose, các phân tử cótrọng lượng lớn di chuyển chậm và khó khăn hơn. Kháng nguyên và kháng thể sau khiđược phủ đầy vào các giếng sẽ khuếch tán toả tròn xung quanh các giếng và hìnhthành građien nồng độ. Khi nồng độ kháng nguyên và kháng thể tương ứng nhau, mộtđường hoặc cung kết tủa xuất hiện. Thông thường đường kết tủa được tạo thành ở tỉ lệkháng thể - kháng nguyên là 4:1. Đường kết tủa được tạo thành giữa kháng nguyên vàkháng thể hoạt động như một hàng rào miễn dịch đặc hiệu, ngăn chặn sự tiếp tụckhuếch tán của các cặp kháng nguyên – kháng thể nhưng không cản trở sự khuếch táncủa từng phân tử kháng nguyên, kháng thể. Khi nhận định kết quả, căn cứ vào đường kết tủa, có thể có 3 trường hợp xảy ra: - Các giếng chứa kháng nguyên đều đồng nhất và tương ứng với kháng thể thì các đường kết tủa gặp nhau và nối liền nhau. Đây là hiện tượng hai kháng nguyên đồng nhất (Hình 2.8A). - Nếu hai giếng chứa kháng nguyên chỉ có một phần tương ứng với một phần khác nhau của kháng thể thì sẽ xuất hiện hai đường kết tủa cắt nhau, tức hai kháng nguyên không có liên quan với nhau. Đây là hiện tượng hai kháng nguyên không đồng nhất nhau (Hình 2.8B). - Nếu hai giếng chứa kháng nguyên có liên quan một phần với kháng thể (cùng có chung một nhóm quyết định A), sẽ tạo ra hai đường kết tủa gặp nhau, nhưng là một đường dài và một đường ngắn hơn (Hình 2.8C). 18 Hình 2.8: Hiện tượng hai kháng nguyên: đồng nhất (A), không đồng nhất (B), đồng nhất một phần (C) được phát hiện bằng phản ứng kết tủa khuếch tán kép trên thạch (Nguồn: Terrance G.Copper, The tools of biochemistry, John Wiley & Sons, New York, 1977)2.7. PHẢN ỨNG TRUNG HOÀ ĐỘC TỐ VT2e TRÊN MÔI TRƯỜNG TẾ BÀOVERO 2.7.1. Sơ lược về tế bào vero[5] Dòng tế bào vero (Vervet Monkey Origin) được Y. Yasumura và Y. Kawakita ởđại học Chiba, Nhật Bản thiết lập vào năm 1962, khởi đầu từ nuôi cấy tế bào thận khỉxanh Châu Phi (Cercopithecus aethiops). Sau một số lần cấy truyền, dòng tế bào nàyđược chuyển đến Tổ chức sưu tầm nhân giống Mỹ - American Type CultureCollection (ATCC). Vào năm 1979, ngân hàng tế bào tiên phát được thành lập từ mộtống tế bào cấy truyền lần thứ 124. Ngân hàng tế bào tiên phát được dùng để sáng lậpngân hàng tế bào đang làm việc (Manufacturers Working Cells Bank – MWCBs).Dòng tế bào này được thử nghiệm nhiều lần để tiếp tục sử dụng cho việc sản xuấtvaccin virus. Thậm chí, lấy dịch nuôi cấy tế bào tiêm vào chuột không có tuyến ức(mất khả năng đề kháng), kết quả nhận được là âm tính, không hình thành khối u. Thửnghiệm DNA bằng kỹ thuật PCR (Polymerase Chain Reaction) ở lần cấy truyền 169,kết quả cho thấy lượng DNA tồn dư không đáng kể. Chính vì thế, lần cấy truyền 137được dùng cho MWCB và lần cấy truyền 142 được dùng để sản xuất tế bào nuôi. Môi trường nuôi cấy tế bào chia làm hai loại, môi trường phát triển và môitrường duy trì. Môi trường phát triển chứa hàm lượng huyết thanh cao 8 – 10%, có tácdụng kích thích sự phát triển của tế bào. Huyết thanh bào thai bê là thích hợp nhất đểthúc đẩy sự phát triển của tế bào vì nó không chứa các yếu tố ức chế tế bào. 19 Tế bào vero tăng trưởng và được duy trì trong môi trường nuôi cấy DMEM(Dulbeccos Minimal Essential Medium) có bổ sung thêm huyết thanh bào thai bê FBS(Fetal Bovine Serum). Môi trường nuôi cấy được điều chỉnh pH bằng sodiumbicarbonate và ủ trong tủ ấm CO2 để duy trì pH 7.2 –7.4. Tế bào vero được nuôi cấy ở37OC, 5% CO2. 2.7.2. Độc tố VT2e[4][9] Vào năm 1977, Konowalchuk và các cộng sự đã đặt tên verotoxin (VT) cho mộtđộc tố do một dòng E. coli tiết ra và gây chết tế bào nuôi cấy. Trong một nghiên cứutrên 136 mẫu phân lập E. coli, 7 trong 10 trường hợp VT dương tính đã kéo theo bệnhtiêu chảy xảy ra ở người và một trường hợp kéo theo bệnh tiêu chảy ở heo. Trong mộtbáo cáo vào năm 1982, O΄ Brient và các cộng tác viên đã cho rằng một vài chủng E.coli gây bệnh đường ruột đã tiết ra một độc tố gây chết tế bào Hela. Cũng giống nhưcác độc tố do Shigella tiết ra và gây độc làm chết tế bào Hela nuôi cấy, các độc tố nàyức chế sự tổng hợp protein trong các tế bào Hela và gây chết chuột. Vì thế, các độc tốnày được gọi là Shiga-like toxin (SLT). Vào năm 1983, O΄Brient và LaCeck đã tinh chế SLT và đã chứng minh rằngShiga toxin do Shigella dysenteriae tiết ra và SLT được tiết từ chủng E. coli H30 làgiống nhau về các đặc tính lý hoá và hoạt tính hoá học. Độc tố SLT-II variant (Shiga-like toxin IIv, SLT-IIv) hay VT2e là một độc tốcó đặc trưng gây độc trên môi trường nuôi cấy tế bào vero (African green monkeykidney) hơn là trên tế bào Hela. Độc tố VT2e bị trung hòa một phần bởi kháng thể củaSLT-II và không bị trung hòa bởi kháng thể của SLT-I. Độc tố SLT-IIv là một phân tửgồm 2 tiểu đơn vị: 1 tiểu đơn vị A khoảng 33 kDa và 5 tiểu đơn vị B khoảng 7.7kDa/đơn vị. Tiểu đơn vị A có hoạt tính enzyme, trong khi tiểu đơn vị B chịu tráchnhiệm cho sự liên kết các SLT với thụ thể có bản chất là glycolipid. Thụ thể cho SLT-IIv là Gl ...