Luận văn: NGHIÊN CỨU MỘT SỐ VIRUS TRÊN KHOAI TÂY (PVX, PVY, PLRV) TẠI ĐÀ LẠT BẰNG KỸ THUẬT ELISA, RT-PCR VÀ GIẢI TRÌNH TỰ (part 5)

- Lượng RNA thích hợp cho phản ứng tổng hợp cDNA là 5 µl. Quy trình nhiệt của phản ứng tổng hợp cDNA phải thay đổi so với kit (tăng thời gian của giai đoạn 42oC từ 30 phút lên 40 phút). Chu kỳ nhiệt trong phản ứng tổng hợp cDNA 25oC trong 5 phút 42oC trong 40 phút 85oC trong 5 phút Giữ ở 4oC - Nồng độ hóa chất phù hợp hợp với quy trình đã nêu, kết quả thu được không có sự hiện diện của sản phẩm phụ. ...
Nội dung trích xuất từ tài liệu:
Luận văn: NGHIÊN CỨU MỘT SỐ VIRUS TRÊN KHOAI TÂY (PVX, PVY, PLRV) TẠI ĐÀ LẠT BẰNG KỸ THUẬT ELISA, RT-PCR VÀ GIẢI TRÌNH TỰ (part 5) 32cDNA - iScript cDNA kit). Kết quả thu được ở lần chạy RT - PCR thứ 3 và có đượcnhững thông số như sau: Bảng 4.5 Kết qủa thành phần hóa chất cho một phản ứng tổng hợp cDNA Thành phần Thể tích 4 µl 5X iScript reaction Mix 1 µl Enzyme 5 µl RNA Nước 10 µl - Lượng RNA thích hợp cho phản ứng tổng hợp cDNA là 5 µl. Quy trình nhiệt của phản ứng tổng hợp cDNA phải thay đổi so với kit (tăng thờigian của giai đoạn 42oC từ 30 phút lên 40 phút). Chu kỳ nhiệt trong phản ứng tổng hợp cDNA 25oC trong 5 phút 42oC trong 40 phút 85oC trong 5 phút Giữ ở 4oC - Nồng độ hóa chất phù hợp hợp với quy trình đã nêu, kết quả thu được không cósự hiện diện của sản phẩm phụ. Lượng cDNA thích hợp cho phản ứng PCR là 5 µl. Bảng 4.6 Kết qủa thành phần hóa chất trong một phản ứng khuếch đại cDNA Thành phần Nồng độ cuối Dung dịch đệm PCR 10X 1X MgCl2 1 mM Hỗn hợp dNTP (dNTP Mix) 0,2 mM Mồi xuôi (sens primer) 0,3 µM Mồi ngược (antisens primer) 0,3 µM 1 U / µl iTaq polymerase Nước Cho vào để đủ 25 µl Tổng thể tích 25 µl - Kết quả cũng cho thấy quy trình nhiệt là ổn định. Chu trình nhiệt trong phản ứng PCR - 94oC trong 5 phút - 94oC trong 1 phút - 50oC trong 1 phút 35 chu kỳ 33 - 72oC trong 1 phút - 72oC trong 10 phút *Kết quả điện di 336bp Hình 4.1 Kết quả điện di cDNA của virus PLRV L1: Thang DNA chuẩn 100 bp L2, L3: cDNA của mẫu 10 (P12) L2: Nồng độ Taq polymerase 1,25 U L3 : Nồng độ Taq polymerase 1 U - Do genome của PLRV không có đuôi poly A, lượng cDNA chỉ được tạo ra từsự kéo dài các hexamer primer (không có cDNA tạo ra từ primer oligo dT) . Điều nàychứng tỏ phản ứng PCR rất nhạy và hiệu quả khuếch đại rất cao. - Sản phẩm RT - PCR từ quy trình có sử dụng Taq của hãng Bio-rad cho kết quảrất chuẩn. Điều này được chứng minh bằng kết quả giải trình tự có được mà không cầntinh sạch sản phẩm RT-PCR. - Cặp primer đã sử dụng có độ đặc hiệu rất cao, chỉ cho đúng 1 band ở vị trí 336bp trên gel điện di. Điều này cho phép khẳng định mẫu này đã bị nhiễm virus PLRV. - Tuy nhiên kết quả trên vẫn còn chưa thuyết phục lắm. Tức là khả năng tồn tạinhững đoạn DNA ngoại lai vẫn có thể xảy ra. Do đó để chắc chắn rằng đây là đoạngen của PLRV ta thực hiện giải trình tự, sau đó so sánh trên ngân hàng gen để có kếtluận cuối cùng. 344.4 Kết quả giải trình tự trực tiếp sản phẩm RT-PCR Kết quả giải trình tự sẽ cho ta trình tự dạng chữ (A, G, T, C) và trình tự dạng peak. Trình tự giải từ sens primer được tổng cộng 314 / 336 nucleotic : GGGGTAGGTAGGACCCTGTGGCACCCAGGCGCCGAAGACGCAGAAGAGGAGGCAATCGCCGCTCTACGAAGAACTGGAGTTCCCCG AGGACGAGGCTCAAGCGAGACATTCGTGTTTACAAAGGACAACCTCGTGGGCAACACCCAAGGAAGTTTCACCTTCGGGCCGAGTCT ATCAGACTGTCCGGCATTCAAGGATGGAATACTCAAGGCCTACCATGAGTATAAGATCACAAGCATCTTACTTCAGTTCGTCAGCGAG GCCTCTTCCACCTCCTCCGGTTCCATCGCTT ATGAGTTGGACCCCCATTGC AA Hình 4.2 Kết quả giải trình tự dạng peak bằng Sense primer Kết quả giải trình tự bằng Antisense primer được 308 / 336 nucleotic: CTAGAGGAGGAGGTGGAGAGGCCTCGCTGACGAACTGAAGTAAGATGCTTGTGATCTTATACTCA TGGTAGGCCTTGAGTATTCCATCC TTGAATGCCGGACAGTCTGATAGACTCGGCCCGAAGGTGAAACTTCCTTGGGTGTTGCCCACGAGGTTGTCCTTTGTAAACACGAATGT CTCGCTTGAGCCTCGTCCTCGGGGAACTCCAGTTCTTCTTGAGCGGCGATTGCCTCCTCTTCTGCGTCTTCGGCGCCTGGGTTGCCCAGG GGCCGTGACCATAACCACTGGC TGAACTCTGT TAGCGCG A Hình 4.3 Kết quả giải trình tự dạng peak bằng Antisense primer Dùng phần mềm CLUSTAL X để so sánh hai trình tự giải được. Kết quả so sánhsẽ cho thấy những vị trí tương đồng và không tương đồng trên đoạn gen đó. Vị trí cácnucleotide tương đồng được đánh dấu “ * ”, không tương đồng dấu “ - ”. Những 35nucleotide tại các vị trí không tương đồng (thường ở đoạn đầu), ta sẽ kết hợp với trìnhtự dạng peak để hoàn chỉnh đoạn gen mong muốn. Dưới đây là kết quả so sánh trình tựgiải được từ 2 primer. Hình 4.4 So sánh kết quả giải trình tự từ 2 primer Trình tự tương đồng *: Trình tự không tương đồng -: Trình tự giải được nhờ Antisense primer anti: Sens: Trình tự giải được nhờ Sense primer Trình tự hoàn chỉnh của đoạn gen mong muốn sẽ có tổng số 339 nucleotic, trongđó có 3 nucleotide loại A, 1 ở đầu 3’ và 2 đầu 5’. Sở dĩ có thêm 3 nucleotic trên là dokết quả của phản ứng PCR (Dr. Mchael blader). Dưới đây là trình ...