Luận văn : ỨNG DỤNG PHƯƠNG PHÁP IN SITU HYBRIDIZATION ĐỂ CHẨN ĐOÁN MẦM BỆNH WSSV (White Spot Syndrome Virus) TRÊN TÔM SÚ (Penaeus monodon) VÀ TSV (Taura Syndrome Virus) TRÊN TÔM THẺ CHÂN TRẮNG (Penaeus vannamei) part 3

Kết quả được đọc dưới KHV quang học và cách đọc như sau: Mẫu dương tính: có các thể vùi trong nhân tạo kết tủa màu xanh đến đen, những tế bào không bị nhiễm virus thì cấu trúc mô bình thường, nhân không bị trương to và bắt màu thuốc nhuộm bổ sung (màu cam). Mẫu âm tính không có màu xanh hoặc đen, chỉ bắt màu Bismark Brown Y (màu thuốc nhuộm bổ sung) và có màu cam sau quá trình lai.
Nội dung trích xuất từ tài liệu:
Luận văn : ỨNG DỤNG PHƯƠNG PHÁP IN SITU HYBRIDIZATION ĐỂ CHẨN ĐOÁN MẦM BỆNH WSSV (White Spot Syndrome Virus) TRÊN TÔM SÚ (Penaeus monodon) VÀ TSV (Taura Syndrome Virus) TRÊN TÔM THẺ CHÂN TRẮNG (Penaeus vannamei) part 3 54 nhuộm bổ sung. nhuộm bổ sung. Kết quả được đọc dưới KHV quang học và cách đọc như sau: Mẫu dương tính: có các thể vùi trong nhân tạo kết tủa màu xanh đến đen, nhữngtế bào không bị nhiễm virus thì cấu trúc mô bình thường, nhân không bị trương to vàbắt màu thuốc nhuộm bổ sung (màu cam). Mẫu âm tính không có màu xanh hoặc đen, chỉ bắt màu Bismark Brown Y (màuthuốcnhuộmbổsung)và cómàucam Hình 4.5: Đối chứng âm Hình 4.6: Đối chứng dươngsau quá trên gan tụy tôm lớn, X40 trên mang tôm lớn, X10trình lai. Hình 4.7: ISH phát hiện WSSV Hình 4.8: ISH phát hiện WSSV trên mẫu gan tụy tôm lớn, X10 trên mẫu mang tôm lớn, X40 55 Như vậy sau hai lần thực hiện thí nghiệm, chúng tôi nhận thấy rằng các mẫu 1,2, 3 có kết quả mô học và PCR dương tính đều cho kết quả ISH dương tính khi đốichứng với mẫu đối chứng dương và đối chứng âm, xác suất trùng hợp giữa ba phươngpháp 100% (3/3). Mẫu số 3 sau khi lai cho kết quả tương đối mờ có thể do trong quátrình thao tác chúng tôi rửa mẫu chưa được sạch lắm, lát cắt mẫu trên lame sau khi laibị dơ. Điều này cũng có thể do quá trình bắt cặp không đặc hiệu giữa probe và trình tựkhông phải DNA đích trong mẫu mô, tạo ra các tín hiệu nền hoặc do thời gian cắt mẫuvới Proteinase K quá lâu, cũng có thể do thao tác nhuộm màu bổ sung chưa tốt. Trong quá trình thực hiện, ta thấy mẫu đối chứng âm sau hai lần thí nghiệm đềukhông xuất hiện những thể kết tủa màu xanh đậm trong nhân, không bị ngoại nhiễm vàcũng không có hiện tượng dương tính giả; trên đối chứng dương thì cấu trúc mô rõràng, tín hiệu lai thu được rất nhiều và rõ khi quan sát dưới KHV quang học chứng tỏrằng quá trình lai được tiến hành rất tốt và không bị ngoại nhiễm. Trên cơ sở thử nghiệm lại quy trình In situ hybridization, chúng tôi nhận thấyrằng khả năng chẩn đoán bệnh đốm trắng trên tôm sú của phương pháp này rất hiệuquả, với độ chính xác cao và kết quả thu được ổn định. Do đó, chúng tôi tiến hành ứngdụng phương pháp này để chẩn đoán và phát hiện mầm bệnh đốm trắng trên tôm súnuôi ở các giai đoạn postlarvae và thương phẩm góp phần vào việc kiểm soát và hạnchế kịp thời những tác hại do WSSV mang lại. Chẩn đoán theo phương pháp này sẽkhắc phục được tính kém đặc hiệu của mô học và tránh được hiện tượng dương tínhgiả của PCR.IV.2.2 Kết quả ứng dụng bộ kit để tìm quy trình ISH tối ưu cho WSSV áp dụngtrong phòng thí nghiệmIV.2.2.1 Kết quả thí nghiệm theo đúng quy trình của bộ kit nhưng có thay đổi mộtsố hóa chất thông dụng không có trong bộ kit Theo cách bố trí này chúng tôi cũng thực hiện lại thí nghiệm trên ba mẫu tôm 1,2 và 3 trên, đối chứng dương và đối chứng âm. Ở đây, chúng tôi dùng cồn tuyệt đối(Việt Nam), xylene và paraformaldehyde (Trung Quốc) trong quy trình lai. Sau khithực hiện thí nghiệm, chúng tôi thu được kết quả sau: 56Bảng 4.9: Kết quả thí nghiệm thực hiện theo quy trình và có thay đổi hoá chất ISH Mẫu Mô PCR học WSSV Lần 1 Lần 2 Mẫu dương (+) và rất rõ Mẫu dương (+) và rõ khi 1 + + khi quan sát dưới KHV. quan sát dưới KHV. Mẫu dương (++), lát cắt Mẫu dương (++), cấu trúc mẫu trên lame không bị mô rõ khi quan sát dưới 2 ++ ++ trôi và rất rõ khi quan sát KHV. dưới KHV. Mẫu dương (+++), lát cắt Mẫu dương (+++), cấu không bị trôi và nhuộm trúc mô rất rõ khi quan sát 3 +++ +++ màu rõ. dưới KHV. Đối Mẫu dương (+++), cấu Mẫu dương (+++), cấu chứng trúc mô rất rõ và nhuộm trúc mô rất rõ và lát cắt +++ +++ dương màu tốt. không bị trôi. Đối Không phát hiện tín hiệu Không phát hiện tín hiệu chứng lai, mẫu không bị nhiễm lai, mẫu không bị nhiễm - - âm bẩn và chỉ bắt màu thuốc bẩn và chỉ bắt màu thuốc 57 nhuộm bổ sung. nhuộm bổ sung. Sau khi thực hiện thí nghiệm này, chúng tôi nhận thấy rằng tiến hành lai theotrường hợp này cho kết quả lai tốt trên cả ba mẫu và hai đối chứng khi quan sát dướiKHV quang học. Kết quả thí nghiệm dựa vào phương pháp ISH cho kết quả trùng hợphoàn toàn với mô học và PCR, xác suất trùng hợp đạt đến 100% (3/3). Nhìn chung kếtquả mà chúng tôi thu được không có sự khác biệt nhiều giữa thí nghiệm theo quy trìnhvà hóa chất của bộ kit với thí nghiệm theo quy trình bộ kit nhưng có thay đổi một sốhóa chất thông dụng rẻ tiền hơn. Đây là một bước thành công mới, tạo tiền đề cho việcphát triển phương pháp ISH phù hợp với điều kiện phòng thí nghiệm tại Viện. Do đó ...