Nghiên cứu xây dựng quy trình phát hiện kiểu gen VEGF và kiểu đột biến gen EGFR ứng dụng trong điều trị đích ung thư phổi

Mục tiêu nghiên cứu của bài viết này nhằm xây dựng quy trình xét nghiệm phát hiện kiểu gen VEGF và kiểu đột biến mất đoạn (Del19(746- 750)), đột biến điểm trên exon 21 (L858R) của gen EGFR. Các dòng tế bào (TB) ung thư phổi không tế bào nhỏ (UTPKTBN) mang đột biến gen EGFR được nuôi cấy trong điều kiện chuẩn. Xác định tính đa hình của gen VEGF bằng phương pháp động học alen đặc hiệu RT-PCR.
Nội dung trích xuất từ tài liệu:
Nghiên cứu xây dựng quy trình phát hiện kiểu gen VEGF và kiểu đột biến gen EGFR ứng dụng trong điều trị đích ung thư phổi TẠP CHÍ Y DƢỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ 2-2014 - KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU CHƢƠNG TRÌNH KHCN KC.10/11-15 NGHIÊN CỨU ÂY DỰNG QUY TRÌNH PH T HI N KI U GEN VEGF V KI U T IẾN GEN EGFR ỨNG D NG TRONG IỀU TRỊ ÍCH UNG THƢ PHỔI Ngô Tất Trung*; Định Ngọc S ** Ng Đặ g ă Khiêm**; ũ X â Phú** Ng iết Nhung** Chi Lă g** TÓM TẮT Xây dựng quy trình xét nghiệm phát hiện kiểu gen VEGF và kiểu đột biến mất đoạn (Del19(746750)), đột biến điểm trên exon 21 (L858R) của gen EGFR. Các dòng tế bào (TB) ung thư phổi không tế bào nhỏ (UTPKTBN) mang đột biến gen EGFR được nuôi cấy trong điều kiện chuẩn. Xác định tính đa hình của gen VEGF bằng phương pháp động học alen đặc hiệu RT-PCR. Xác định đột biến gen EGFR bằng PCR đa mồi đặc hiệu alen hai hướng tích hợp công nghệ ARMS và kiểm tra lại bằng giải trình tự gen. Xác định ngưỡng phát hiện và độ đặc hiệu của phương pháp bằng cách pha loãng nồng độ TB theo tỷ lệ 0:100, 0.1:100, 1:100, 10:100 và 100:100, sau đó tiến hành tách ADN làm khuôn cho phản ứng PCR. Kết quả: đã hoàn thiện kỹ thuật động học alen đặc hiệu RT-PCR cho phép phát hiện đồng thời hai thể đa hình Rs833061 và Rs3025039 của gen VGFR. Công nghệ PCR đặc hiệu hai hướng alen cũng cho phép xác định được đột biến gen EGFR tại exon 19, exon 21 với ngưỡng phát hiện 0,1%. Độ đặc hiệu kỹ thuật 100%. Giải trình tự gen đã khẳng định kết quả của PCR đa mồi. PCR đa mồi đặc hiệu alen hai hướng tích hợp công nghệ ARMS có ngưỡng phát hiện thấp hơn so với giải trình tự gen (0,1% so với 25%). * Từ khóa: Ung thư phổi; Ung thư phổi không tế bào nhỏ; EGFR; VEGF; PCR đa mồi. ESTABLISHING ASSAYS FOR GENOTYPING VEGF AND IDENTIFYING EGFR MUTATIONS APPLYING FOR TARGET THERAPY OF LUNG CANCER SUMMARY The aims of study are to set-up a molecular diagnostic protocol for detecting exon 19 Del19 (746-750), exon 21 point mutation (L858R) of epithelial growth factor receptor (EGFR) and geneotyping VEGF SNPs Rs3025039, RS833061. Cell lines carrying mutation of EGFR were cultured by standard conditions and treated as reference for optimizing the assays. Mutations of EGFR gene were detected by bidirectional allele specific PCR combined with amplification refractory mutation system, its sensitivity and specificity were monitored by titrating mutant positive cells in to mutant negative counterpart into a series from 0:100, 0.1:100, 1:100, 10:100 and 100. On the other hand, allelic variants of VEGF was acquired by allele specific kinetics PCR with referring to Sanger sequencing. Results: Multiplex-PCR EGFR mutation assay can identify nucleotide modification at exon 19, exon 21 with sensitivity is 0.1%; 1% and 1%, respectively. Sequencing had confirmed the results of multiplex-PCR but its sensitivity is less than multiplex-PCR (> 5%). The concordance was also established between our novel VEGF allelic screening assay and Sanger sequencing. * Từ khóa: Lung cancer; Non-small cell lung cancer; EGFR; VEGF; Multiplex-PCR. * Bệnh viện TWQĐ 108 ** Bệnh viện Phổi TW Người phả hồi (Corresponding): Ng Tất Tr g ( tatr g@ ahoo.com) Ngà hậ bài: 25/12/2013 Ngà phản biện đá h giá bài báo: 20/1/2014 Ngà bài báo được đă g: 21/1/2014 48 t¹p chÝ y d-îc häc qu©n sù sè 2-2014 - kÕt qu¶ nghiªn cøu ch-¬ng tr×nh KHcn kc.10/11-15 ẶT VẤN Ề Ung thư phổi (UTP) là bệnh gây tử vong cao nhất trong số các bệnh ung thư. Dựa trên hình thái TB, chia UTP thành UTP TB nhỏ (UTPTBN) và UTPKTBN. UTPTBN chiếm 15 - 20%, còn lại 80 - 85% số ca UTP là UTPKTBN. Do phác đồ hóa trị hoặc xạ trị tương đối có hiệu quả đối với UTPTBN, nên các nghiên cứu lâm sàng tập trung nhiều vào việc chữa trị cho bệnh nhân (BN) UTPKTBN. Một đặc điểm nổi bật của UTPKTBN là sự gia tăng mức độ biểu hiện của thụ thể biểu mô (epithelial growth factor receptor EGFR), thụ thể này mang hoạt tính tyrosine kinase. Hoạt động của enzym này lại phụ thuộc nhiều vào tương tác giữa EGFR với các phân tử ATP tự do trong bào tương. Một khi EGFR thu nhận được ATP, nó sẽ chuyển sang trạng thái bị kích hoạt và truyền tín hiệu sống sót tới nhân bào, hỗ trợ cho quá trình tăng sinh của TB đồng thời tăng khả năng di căn của TB ung thư tới các mô lân cận. Hiện nay, trên thị trường dược phẩm tồn tại hai hợp chất có khả năng ức chế EGFR đã được Cơ quan Quản lý Thực phẩm và Dược phẩm Hoa Kỳ (FDA) cho phép sử dụng trong điều trị UTPKTBN giai đoạn muộn là gefitinib, erlotinib. Việc chỉ định sử dụng các dược phẩm này phụ thuộc vào trạng thái đột biến của gen EGFR. Nhiều nghiên cứu cho thấy, tăng sinh mạch là một trong những tính chất bệnh sinh ác tính điển hình ở UTP: do nhu cầu dinh dưỡng và nhu cầu trao đổi chất cao hơn mức bình thường, do đó đòi hỏi sự hình thành nhiều hệ thống mạch máu mới, vì thế TB ác tính bài tiết ra tác nhân tăng sinh mạch (Vascular endothelial growth factor VEGF). Tuy nhiên, VEGF không bộc lộ trên bề mặt TB ác tính mà tuần hoàn trong môi trường và tác động lên thụ thể đặc hiệu trê ...