Phát hiện các điểm đột biến trên gen gyra và parc của các chủng vi khuẩn lậu phân lập

Bài viết Phát hiện các điểm đột biến trên gen gyra và parc của các chủng vi khuẩn lậu phân lập trình bày nghiên cứu về tình hình kháng kháng sinh và giải thích cơ chế đề kháng của vi khuẩn lậu là rất cần thiết. Tiến hành giải trình tự gen của 71 chủng vi khuẩn lậu được phân lập từ những bệnh nhân có hội chứng tiết dịch niệu đạo, âm đạo đến khám tại Bệnh viện Da liễu Trung ương nhằm tìm hiểu cơ chế đề kháng với kháng sinh ciprofloxacin của vi khuẩn lậu,... Mời các bạn cùng tham khảo.
Nội dung trích xuất từ tài liệu:
Phát hiện các điểm đột biến trên gen gyra và parc của các chủng vi khuẩn lậu phân lập TẠP CHÍ NGHIÊN CỨU Y HỌC PHÁT HIỆN CÁC ĐIỂM ĐỘT BIẾN TRÊN GEN GYRA VÀ PARC CỦA CÁC CHỦNG VI KHUẨN LẬU PHÂN LẬP Lê Văn Hưng Trường Đại học Y Hà Nội Nghiên cứu về tình hình kháng kháng sinh và giải thích cơ chế đề kháng của vi khuẩn lậu là rất cần thiết. Tiến hành giải trình tự gen của 71 chủng vi khuẩn lậu được phân lập từ những bệnh nhân có hội chứng tiết dịch niệu đạo, âm đạo đến khám tại Bệnh viện Da liễu Trung ương nhằm tìm hiểu cơ chế đề kháng với kháng sinh ciprofloxacin của vi khuẩn lậu. Kết quả cho thấy các chủng nhạy cảm có nồng độ ức chế tối thiểu (Minimum Inhibitory Concentratation - MIC) 0,002 - 0,060 µg/ml không có đột biến gen. Các chủng có MIC càng cao càng xuất hiện nhiều đột biến trên gen gyrA và parC. Trên gen gyrA: 100% số chủng có đột biến tại codon 91 (Ser thành Phe). 63,8% số chủng có đột biến tại codon 95 (Asp thành Ala), các đột biến ở vị trí khác có tần số thấp hơn. Trên gen parC: 44,9% số chủng có đột biến tại codon 87 (Ser thành Asn). Đột biến ở codon 86 và 91 xuất hiện với tần số thấp hơn. Từ khóa: vi khuẩn lậu, kháng kháng sinh, ciprofloxacin, đột biến gen I. ĐẶT VẤN ĐỀ Ciprofloxacin là một kháng sinh được chỉ định điều trị bệnh lậu với liều uống duy nhất (500 mg), vì vậy kháng sinh này được thầy thuốc và bệnh nhân rất ưa chuộng. Do đó, việc lạm dụng kháng sinh này đã dẫn tới tốc độ đề kháng đang tăng nhanh và nếu không có biện pháp can thiệp hữu hiệu, ciprofloxacin có thể trở thành kháng sinh không có tác dụng đối với vi khuẩn lậu trong thời gian tới. Nhiều nghiên cứu của các nhà khoa học trên thế giới như Trees D. L và cộng sự (1998) tại Trung tâm phòng chống bệnh xã hội Atlanta, Mỹ [1], Su X. và Lind I. (2001) tại Đan Mạch [2]... về những chủng vi khuẩn lậu kháng ciprofloxacin cho thấy: những chủng đề kháng với ciprofloxacin đều có những thay đổi trên gen gyrA và gen parC. Đó là các gen có liên quan đến kháng ciprofloxacin. Gen gyrA có độ dài Địa chỉ liên hệ: Lê Văn Hưng - Bộ môn Da liễu - Trường Đại học Y Hà Nội Email: levanhungvdl@yahoo.com Ngày nhận: 26/03/2013 Ngày được chấp thuận: 20/6/2013 TCNCYH 83 (3) - 2013 2.751 nucleotide, mã hoá 916 amino acid; vùng quyết định đề kháng quinolon dài khoảng 279 nucleotide, mã hoá 93 amino acid. Gen parC có độ dài 2.307 nucleotide, mã hoá 768 amino acid; vùng quyết định đề kháng quinolon dài khoảng 255 nucleotide, mã hoá 85 amino acid. Những nghiên cứu về tình hình kháng kháng sinh, cơ chế đề kháng của vi khuẩn lậu là rất cần thiết và phải được tiến hành thường xuyên nhằm đóng góp hữu hiệu cho công tác phòng chống các bệnh lây truyền qua đường tình dục nói chung và bệnh lậu nói riêng. Xuất phát từ những lý do trên đề tài nghiên cứu được tiến hành nhằm mục tiêu: góp phần tìm hiểu cơ chế đề kháng với kháng sinh ciprofloxacin của vi khuẩn lậu. II. ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP 1. Đối tượng Trong khoảng thời gian từ năm 2005 đến 2007, có 5.091 bệnh nhân có hội chứng tiết dịch niệu đạo, âm đạo đến khám tại bệnh viện Da liễu Trung ương, phân lập được 503 chủng. Nghiên cứu này đã chọn ngẫu nhiên 6 35 TẠP CHÍ NGHIÊN CỨU Y HỌC tháng từ tháng 7 năm 2007 đến tháng 12 năm 3. Phương pháp 2007 được 71 chủng vi khuẩn lậu. 3.1. Kỹ thuật xác định vi khuẩn lậu 2. Vật liệu Nhuộm Gram →Nuôi cấy trên môi trường Tủ nuôi cấy CO2 Sanyo (Nhật Bản). Môi Thayer - Martin →Test Oxidase và Neisseria 4H trường Thayer - Martin, Neisseria 4H, Oxidase → Kết luận: Neisseria gonorrhoear → Tiến hành kỹ thuật kháng sinh đồ: sử dụng E - test để xác định MIC của vi khuẩn lậu. (Mỹ). Thanh giấy E - test (Thụy Điển). Chủng chuẩn: ATCC 49226 (WHO cung cấp) (bảng 1). Bảng 1. Các đoạn mồi dùng trong phản ứng PCR và giải mã trình tự gen [3] Trình tự mồi (5’ - 3’) Gen Kích thước đoạn gen được khuếch đại Mồi xuôi Mồi ngược CGGCGCGTACTGTACGCGATGCA AATGTCTGCCAGCATTTCATGTGAGA GyrA 279bp Mồi xuôi Mồi ngược ATGCGCGATATGGGTTTGAC GGACAACAGCAATTCCGCAA ParC 255bp Thiết kế 3.2. Quy trình PCR đối với gen gyrA và gen parC Sử dụng hóa chất của hãng Bio - rad (Hoa Kỳ) với 2 cặp mồi đặc hiệu để tiến hành quy trình PCR đối với gen gyrA và gen parC. Thành phần phản ứng: Dung dịch đệm 10x (5 ml); dNTP 10 mM (1 ml); MgCl2 50 mM (1,5 3.3. Quy trình giải trình tự gen Quy trình giải trình tự đoạn gen có thể chứa đột biến được thực hiện theo quy trình hướng dẫn của hãng. a. Tinh sạch sản phẩm PCR bằng MinElute PCR Purification Kit: Thêm 200 ml buffer PB vào 40 ml sản ml); Taq polymerase 5 UI/ml (0,5 ml); Dung dịch DNA (5 ml); Mồi xuôi 10 mM (2,5 ml); Mồi phẩm PCR, trộn đều bằng pipet. Cho toàn bộ ngược 10 mM (2,5 ml); Nước khử ion (32 ml). Tổng thể tích là 50 ml. dịch vào cột chiết tách. Ly tâm 13.000 vòng/ phút trong 1 phút. Hút bỏ phần dịch lọc. Thêm - Chu kỳ nhiệt: 93oC 3 phút - [93oC 30 giây - 52oC 1 phút 72 C 1 phút] x 30 chu kì - 72oC 5 phút. o - Sản phẩm khuếch đại gen Điện di sản phẩm PCR trên gel agarose 750 ml buffer PE, ly tâm 13.000 vòng ...