Tách dòng và biểu hiện đoạn gen mã hóa vùng quyết định kháng nguyên 56 KDA của vi khuẩn Orientia tsutsugamushi trong Escherichia coli

Trong nghiên cứu này, nhóm tác giả trình bày kết quả tách dòng và biểu hiện đoạn gen mã hóa vùng quyết định kháng nguyên 56 kDa của O. tsutsugamushi thuộc nhóm Karp từ mẫu HT-09 thu thập ở Bệnh viện Quân y 105 trong tế bào E. coli BL21. Kháng nguyên 56 kDa tái tổ hợp (HT-09) sau đó được tinh chế và sử dụng làm nguyên liệu để tạo bộ kit ELISA phát hiện O. tsutsugamushi.
Nội dung trích xuất từ tài liệu:
Tách dòng và biểu hiện đoạn gen mã hóa vùng quyết định kháng nguyên 56 KDA của vi khuẩn Orientia tsutsugamushi trong Escherichia coli Nghiên cứu khoa học công nghệ TÁCH DÒNG VÀ BIỂU HIỆN ĐOẠN GEN MÃ HÓA VÙNG QUYẾT ĐỊNH KHÁNG NGUYÊN 56 KDA CỦA VI KHUẨN ORIENTIA TSUTSUGAMUSHI TRONG ESCHERICHIA COLI (1) (1) (2) LÊ THỊ LAN ANH , NGUYỄN VĂN MINH , TRỊNH VĂN TOÀN , (1) (1) BÙI THỊ THANH NGA , VÕ VIẾT CƯỜNG 1. ĐẶT VẤN ĐỀ Bệnh sốt mò hay sốt bụi rậm (scrub typhus) là bệnh truyền nhiễm cấp tính, lây truyền từ động vật sang người thông qua vector truyền bệnh là ấu trùng mò. Tác nhân gây bệnh sốt mò là vi khuẩn Orientia tsutsugamushi ký sinh nội bào bắt buộc và bắt màu Gram âm. Bệnh lưu hành phổ biến ở khu vực Châu Á-Thái Bình Dương. Hàng năm có xấp xỉ 1 triệu ca bệnh và trên 1 tỷ người có nguy cơ mắc bệnh [5]. Dựa trên đặc điểm của kháng nguyên bề mặt đặc hiệu 56 kDa, O. tsutsugamushi được chia thành các nhóm huyết thanh khác nhau như: Gilliam, Kato, Karp, Boryong, TA763… Bằng Western blot, các nhà khoa học đã phát hiện ra 4 kháng nguyên của vi khuẩn có kích thước 22 kDa, 47 kDa, 56 kDa và 110 kDa. Trong đó, kháng nguyên 56 kDa chiếm 10-15% protein tổng số tế bào, mang tính đặc hiệu cao và không biểu hiện ở các Rickettsia khác [3]. Trong huyết thanh bệnh nhân sốt mò mang kháng thể kháng kháng nguyên 56 kDa với hiệu giá cao, do đó xét nghiệm chẩn đoán huyết thanh dựa trên kháng nguyên 56 kDa được sử dụng rộng rãi để chẩn đoán bệnh sốt mò [4, 9]. Sự lưu hành của các nhóm O. tsutsugamushi thay đổi theo khu vực địa lý, giữa các nhóm O. tsutsugamushi có sự khác biệt cao về mặt di truyền gen mã hóa cho kháng nguyên 56 kDa [5]. Vì vậy, để tăng độ nhạy các sinh phẩm phát hiện nhiễm O. tsutsugamushi hỗn hợp protein 56 kDa tái tổ hợp của các nhóm O. tsutsugamushi [7, 14] đã được nghiên cứu phối trộn. Gen mã hóa kháng nguyên 56 kDa có 4 vùng biến đổi đóng vai trò quan trọng trong quyết định kháng nguyên, việc loại bỏ 80 axit amin đầu N và 80 axit amin đầu C của kháng nguyên không làm ảnh hưởng đến vai trò đó [3, 4]. Kết quả một số nghiên cứu cho thấy nhóm Karp lưu hành phổ biến ở Việt Nam [11, 12]. Trong số 12 mẫu bệnh phẩm thu thập năm 2016 tại Bệnh viện Quân y 105 dương tính với O. tsutsugamushi đã xác định 8 chủng thuộc nhóm Karp [1]. Trong nghiên cứu này, nhóm tác giả trình bày kết quả tách dòng và biểu hiện đoạn gen mã hóa vùng quyết định kháng nguyên 56 kDa của O. tsutsugamushi thuộc nhóm Karp từ mẫu HT-09 thu thập ở Bệnh viện Quân y 105 trong tế bào E. coli BL21. Kháng nguyên 56 kDa tái tổ hợp (HT-09) sau đó được tinh chế và sử dụng làm nguyên liệu để tạo bộ kit ELISA phát hiện O. tsutsugamushi. 2. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP 2.1. Chủng vi sinh vật, plasmid và huyết thanh - Chủng vi khuẩn E. coli DH5α [end A1 rec A1 hsd R17 sup E44 gyp A96 thi-1 relA1Δ lac U169 (φ80 lacZM15)], E. coli BL21 [F-omp hsd SB (rBmB) gel dem (DE3) plysS (Caml)] (Invitrogen) được sử dụng để nhân dòng và biểu hiện đoạn gen mã hóa kháng nguyên 56 kDa. Tạp chí Khoa học và Công nghệ nhiệt đới, Số 13, 11 - 2017 67 Nghiên cứu khoa học công nghệ - Vector tách dòng và biểu hiện pET22b(+) (Invitrogen). - DNA tổng số tách chiết từ mẫu máu bệnh nhân sốt mò (HT-09) do Bệnh viện Quân y 105 (Sơn Tây, Hà Nội) cung cấp được sử dụng làm khuôn để nhân đoạn gen mã hóa kháng nguyên 56 kDa. - Huyết thanh bệnh nhân sốt mò (xác định bằng nested PCR) [5], dương tính với kháng thể kháng kháng nguyên 56 kDa O. tsutsugamushi (xác định bằng test nhanh SD-bioline, Hàn Quốc) được sử dụng để lai Western blot. 2.2. Phương pháp nghiên cứu 2.2.1. Thiết kế vector tách dòng và biểu hiện pET22b(+) mang trình tự mã hóa cho kháng nguyên 56 kDa Đoạn gen ht-09 mã hóa cho một phần kháng nguyên 56 kDa có kích thước 1149 bp được khuếch đại bằng phản ứng PCR sử dụng cặp mồi P2BKARPF 5’- AAG GCC ATG GCT ATG ACA ATT GCT CAA GGT TTT AGA-3’ / NcoI và P22BKARPR 5- GAC GTC GAC AAG CTT CTC GAG AAC ACC AGC ATA TAT TGA -3/XhoI (phần chữ được gạch chân là trình tự nhận biết của enzyme giới hạn tương ứng). Chương trình phản ứng PCR như sau: 98oC trong 30 giây, 25 chu kì với mỗi chu kỳ gồm 98oC trong 10 giây, 53oC trong 30 giây và 72oC trong 1 phút và giai đoạn kéo dài được thực hiện ở 72oC trong 10 phút. Sản phẩm PCR được điện di kiểm tra trên gel agarose 1% và tinh sạch bằng PCR purification kit (Thermo Scientific). Sản phẩm PCR sau tinh sạch được cắt tạo đầu dính bằng enzyme giới hạn NcoI và XhoI, sau đó ghép nối vào vector pET22b(+) bằng enzyme nối T4 DNA ligase (Thermo Scientific) tạo thành plasmid tái tổ hợp pET22b_ht-09. 2.2.2. Biểu hiện đoạn gen ht-09 trong tế bào E. coli BL21 Tế bào E. coli BL21 mang plasmid tái tổ hợp pET22b_ht-09 ...