Thí nghiệm Sinh học phân tử - Bài 2

KỸ THUẬT PHA CHẾ MÔI TRƯỜNG 1.VẤN ĐỀ LỰA CHỌN MÔI TRƯỜNG Khi khởi sự nuôi cấy mô và tế bào đối với một số đối tượng nhất định, vấn đề đặt ra là chọn môi trường nào và trên cơ sở nào để phối hợp tỷ lệ các chất dinh dưỡng. Cách thường làm là qua các tài liệu đã xuất bản, các công trình đã nghiên cứu về đối tượng đó hoặc cùng họ tương đương xem các tác giả đã sử dụng môi trường loại nào. Bước đầu có thể giữ nguyên môi trường của...
Nội dung trích xuất từ tài liệu:
Thí nghiệm Sinh học phân tử - Bài 2Thí nghiệm Sinh học phân tử Biên soạn : Lê Lý Thuỳ Trâm -1- BÀI 2: KỸ THUẬT PHA CHẾ MÔI TRƯỜNG ^!^ 1.VẤN ĐỀ LỰA CHỌN MÔI TRƯỜNG Khi khởi sự nuôi cấy mô và tế bào đối với một số đối tượng nhất định, vấn đề đặt ra là chọnmôi trường nào và trên cơ sở nào để phối hợp tỷ lệ các chất dinh dưỡng. Cách thường làm là quacác tài liệu đã xuất bản, các công trình đã nghiên cứu về đối tượng đó hoặc cùng họ tương đươngxem các tác giả đã sử dụng môi trường loại nào. Bước đầu có thể giữ nguyên môi trường của tácgiả đó hoặc trên cơ sở đó mà cải tiến cho phù hợp qua các thí nghiệm thăm dò. Trong hàng trăm môi trường do rất nhiều tác giả đề nghị cho nhiều loại cây khác nhau, nhiềumục đích nuôi cấy khác nhau. Về cơ bản có thể chia ra làm 3 loại: - Môi trường nghèo chất dinh dưỡng: điển hình là môi truờng White,Knop và Knudson C … - Môi trường có hàm lượng chất dinh dưỡng trung bình: điển hình làmôi trường B5 củaGamborg … - Môi trường giàu dinh dưỡng: điển hình là môi trường MS (Murashige-Skoog)… Vì vậy khi bắt đầu nghiên cứu nuôi cấy mô một số đối tượng mới, chưa có tài liệu trước thì nênthăm dò so sánh 3 loại môi trường trên xem đối tượng nghiên cứu phù hợp với loại môi trườngnào nhất. Sau đó cần thử tìm tỉ lệ NO3/ NH4+ thích hợp. Các tác giả phương Tây làm việc với câytrồng cạn thường không đưa NH4+ vào môi trường. Nhưng đối với những cây dinh dưỡng NH4+mạnh như cây lúa, việc thêm vào môi trường nuôi cấy một tỉ lệ NH4+ thích hợp chắc chắn sẽ cólợi. Việc sử dụng mang tính kinh nghiệm chủ nghĩa đối với một số môi trường đã cản trở khánhiều sự tiến bộ của công tác ở một số phòng thí nghiệm nuôi cấy mô thực vật. Thuốc lá và carốtlà 2 loại cây kinh điển của nuôi cấy mô thực vật. Môi trường nuôi cấy 2 loại cây này đã được xây dựng khá hoàn chỉnh.Tuy vậy, không thể dùng nguyên các môi trường đó để nghiên cứu các cây hoà thảo hoặc các câyhọ đậu mà không có sự cải tiến, sửa đổi. Điều này giải thích sự tiến bộ chậm chạp của nuôi cấymô một số cây hoà thảo so với cây 2 lá mầm. Hiện nay, môi trường MS được coi như là môi trường thích hợp với nhiều loại cây do giàu vàcân bằng về mặt dinh dưỡng. Vì vậy, những người tập sự làm nuôi cấy mô thường bắt đầu vớimôi trường này trước khi tìm được môi trường của riêng mình. 2.CHUẨN BỊ MÔI TRƯỜNG Để thuận tiện cho việc pha các môi trường nuôi cấy người ta không cân hoá chất mỗi lần phamà thường chuẩn bị trước dưới dạng các dung dịch đậm đặc (còn gọi là các stock), sau đó chỉ cầnpha loãng khi sử dụng. Các stock này thường được bảo quản dài ngày trong tủ lạnh thường hoặctủ lạnh sâu. 2.1 Thành phần môi trường dinh dưỡng Nước cất Chất hữu cơ - Đường- Acid amin- Vitamin (B1, B6, H, PP…)- Các chất điều hòa sinh trưởng thực vật (Auxin, Cytokinin,Gibberellin…) Chất vô cơ Đa lượng N P K Ca Mg SCông Nghệ Sinh Học Việt Nam -1- BiotechnologyThí nghiệm Sinh học phân tử Biên soạn : Lê Lý Thuỳ Trâm -2- Vi l ư ợng Fe Zn B Co N Mn Cu Al Mo I Các hợp chất không biết rõ thành phần Nước dừa, nước khoai tây, nước chuối, casein,hydrolysalt, trypton, pepton…Công Nghệ Sinh Học Việt Nam -2- BiotechnologyThí nghiệm Sinh học phân tử Biên soạn : Lê Lý Thuỳ Trâm -3- THÀNH PHẦN MUỐI KHOÁNG CƠ BẢN CỦA MÔI TRƯỜNG MS (Murashige và Skoog, 1962) SKOOG I SKOOG II SKOOG III NH4NO3 FeSO4.7H2O KI 1650 mg/L 27,8 mg/L 0,83 mg/L KNO3 MnSO4 Na2MoO4.2H2O 1900 mg/L .4H2O 0,25 mg/L KH2PO4 22,3 mg/L CuSO4.5H2O 170 mg/L H3BO3 0,025 mg/L MgSO4.7H2O 6,2 mg/L CoCl2.6H2O 370 mg/L ZnSO4.7H2O 0,025 mg/L CaCl2.2H2 8,6 mg/L 440 mg/L Na2EDTA 37,3 mg/L THÀNHPHẦN VITAMIN CỦA MOREL Morel’sVitamin Pirydox Biotin Meso- Nicotin Thiami Pantotaine (B6) (H) inositol ic acid n –HCl te Calci 1 mg/L 0,01 100 (P.P) (B1) 1 mg/L mg/L mg/L 1 mg/L 1 mg/L 2.2 Cách pha các dung dịch mẹ (stock) * Stock đa lượng MS : SKOOG I (x10) ...