Thí nghiệm Sinh học phân tử - Bài 3

GIEO HẠT IN-VITRO I.CHỌN MÔ CẤY VÀ XỬ LÝ MÔ CẤY 1.1 Chọn lựa mô cấy Không có những hướng dẫn cụ thể trong việc chọn mô cấy. Về nguyên tắc, trừ những mô cấy đã hóa gỗ, các mô khác trong cơ thể thực vật đều có thể dùng làm mô cấy. Tuy vậy có thể nhận xét chung là các mô đang phát triển, thịt quả non, lá non, cuống hoa, đế hoa, mô phân sinh… khi đặt vào môi trường có chứa một lượng chất sinh trưởng thích hợp đều có khả năng phân chia và...
Nội dung trích xuất từ tài liệu:
Thí nghiệm Sinh học phân tử - Bài 3Thí nghiệm Sinh học phân tử Biên soạn : Lê Lý Thuỳ Trâm -1- BÀI 3: GIEO HẠT IN-VITRO ^!^ I.CHỌN MÔ CẤY VÀ XỬ LÝ MÔ CẤY 1.1 Chọn lựa mô cấy Không có những hướng dẫn cụ thể trong việc chọn mô cấy. Về nguyên tắc, trừ những mô cấyđã hóa gỗ, các mô khác trong cơ thể thực vật đều có thể dùng làm mô cấy. Tuy vậy có thể nhậnxét chung là các mô đang phát triển, thịt quả non, lá non, cuống hoa, đế hoa, mô phân sinh… khiđặt vào môi trường có chứa một lượng chất sinh trưởng thích hợp đều có khả năng phân chia vàphân hóa. Để bắt đầu nghiên cứu nhân giống vô tính một cây nhất định, trước tiên người ta chú ýđến các chồi nách và mô phân sinh ngọn. Cần biết rằng tuy mang một lượng thông tin di truyềnnhư nhau, các mô khác nhau trên cùng một cây có thể sinh trưởng và phát triển với khả năng táisinh chồi, rễ hay cây hoàn chỉnh rất khác nhau. Vì vậy, khi khởi sự chọn giống, nhân giống mộtcây cụ thể bằngphương pháp nuôi cấy môvà tế bào thực vật, trước hết cần thí nghiệm tìm hiểuphản ứng của các bộ phận khác nhau của cấy trong nuôi cấy ở các nồng độ chất sinh trưởng khácnhau. Sau khi cấy, mô cấy cần được đặt trong điều kiện nhiệt độ và ánh sáng ổn định. Tuỳ vàocác mục đích nghiên cứu mà có các chế độ chiếu sáng khác nhau, chẳng hạn quá trình tạo mô sẹocó thể cần bóng tối hay ánh sáng, nhưng quá trình tái sinh và nhân giống vô tính nhất thiết phảicó ánh sáng. Nhiệt độ phòng nuôi nên giữ ổn định 25+2oC bằng máy điều hòa nhiệt độ. Cường độchiếu sáng khoảng từ 2000 –3000 lux. 1.2 Xử lý vô trùng mẫu cấy Mẫu đưa vào nuôi cấy invitro có nhiều nguồn gốc khác nhau. Có thể là những mẫu cấy đã vôtrùng như cây con invitro cho nảy mầm trong điều kiện vô trùng; cũng có thể đó là các mẫu cấychưa vô trùng, lấy trực tiếp từ bên ngoài tự nhiên như chồi non, lá, thân, củ, rễ… Thuận lợi nhấtlà sử dụng các mẫu cấy đã vô trùng bởi lẽ các phương pháp vô trùng mẫu cấy trực tiếp thường ítnhiều gây hại cho mẫu cấy do chất khữ trùng gây ra. Có nhiều phương thức vô trùng mẫu cấy: a. Vô trùng hạt: - Rửa hạt bằng xà phòng, lắc đều 2-3 phút. Với các loại hạt nhỏ, thường đựng hạt trong túi vải mùng. - Rửa sạch xà phòng bằng nước máy dưới vòi nước chảy mạnh - Vô trùng sơ bộ bằng cồn 70%, lắc đều 1-2 phút - Rửa sạch cồn bằng nước vô trùng - Cho hạt vào dung dịch khử trùng NaOCl 1-15%. Thêm vài giọt bám dính Tween20. Khử trùng trong 15-20 phút tuỳ mẫu. - Rửa sạch chất khử trùng nhiều lần bằng nước vô trùng (khoảng 5 lần) cho đến khi hết mùi javel. - Hạt vô trùng đã có thể nuôi cấy trên môi trường tạo mẫu vô trùng. b. Các phương thức khác vô trùng hạt - Khử trùng lần thứ nhất với NaOCl 5,25% - Khử trùng lần thứ hai với HgCl2 0,1 –1%, thêm vài giọt HCl 0,5% trong 10 phút. - Rửa mẫu với H2O2 6% vô trùng trước khi rửa lại bằng nước vô trùngCông Nghệ Sinh Học Việt Nam -1- BiotechnologyThí nghiệm Sinh học phân tử Biên soạn : Lê Lý Thuỳ Trâm -2- - Có thể khử trùng sơ bộ hạt bằng acid sulfuric trong 2-10 phút - Với hạt có vỏ cứng, có thể dùng phương pháp đốt để khử trùng sơ bộ. c. Vô trùng chồi non, lá và thân cỏ: - Vô trùng sơ bộ bằng cách ngâm mẫu vào cồn 70% trong 1-3 phút, thờI gian xử lý này cũngcòn tuỳ thuộc vào độ cứng hay mềm của mẫu - Vô trùng mẫu với chất khử trùng NaOCl 1% hay với javel thương phẩm theo tỉ lệ 1:4 hay1:5 trong thời gian 5-20 phút tuỳ theo mẫu - Rửa lại bằng nước vô trùng cho sạch hoàn toàn chất khử trùng d. Vô trùng củ, rễ - Mẫu nuôi cấy phải được rửa dưới vòi nước chảy mạnh cho thật sạch đất cát bám trên mẫu,sau đó ngâm trong nước xà phòng loãng 10 phút - Vô trùng sơ bộ bằng cồn 70% trong 1 -5 phút - Vô trùng với chất khử trùng có nồng độ và thời gian thay đổi tuỳ mẫu - Rửa lại bằng nước vô trùng cho thật sạch chất khử trùng e. Tránh hoại mẫu Trong quá trình nuôi cây thường xuất hiện nhiễm là do trong quá trình nuôi cấy đã để bào tửtrong không khí rơi vào hay mẫu cấy chưa được vô trùng hoàn toàn. Sau một thời gian thì bào tửphát triển nhanh chóng và có thể sẽ làm chết mẫu hoặc cạnh tranh chất dinh dưỡng làm mẫukhông phát triển. Hoại mẫu thường do nấm mốc (khuẩn lạc có dạng sợi) hoặc do khuẩn (khuẩnlạc có dạng ván nhầy). Nếu nấm hoặc khuẩn chỉ mọc tr6en bề mặt môi tr ường, đó thường lànhiễm do thao tác cấy chưa tốt; nếu có khắp trong môi trường là nhiễm do môi trường chưa đượctiệt trùng hoàn toàn; còn nếu khuẩn và nấm xuất phát từ gốc mẫu lan ra thì đó là do mẫu chưađược khử trùng triệt để. Tuỳ theo quan sát và dựa vào kinh nghiệm của người cấy mà có nhậnđịnh chính xác về nguyên nhân gây hoại mẫu để tìm cách khắc phục tình trạng này. Trong trườnghợp các bình nuôi cấy đã bị nhiễm, cần được hấp bỏ trước khi đem đi rửa sạch để tránh lây lannguồn nhiễm trong khu vực cấy. 2.THỰC HÀNH 2.1 Mục đích Giúp cho sinh viên làm quen với thao tác vô trùng mẫu cấy và kỹ thuật cấy vô trùng 2.2 Dụng cụ, thiết bị và hóa chất 2.2.1 Dụng cụ: - Bécher (cốc đốt thuỷ - Forceps (kẹp), dao cấy, - Bình tam giác (250mL) - Giấy cấy vô trùng đèn cồn tinh) 500mL, 1000mL - Đĩa petri vô trùng 2.2.2 Thiết bị: - Tủ lạnh - Máy khuấy từ - Autoclave - Tủ sấy - Cân kỹ thuật - pH kế - Tủ cấy (laminar) - Máy cất nước 2 lầnCông Nghệ Sinh Học Việt Nam -2- ...