THỰC HÀNH VỀ NUÔI CẤY MÔ THỰC VẬT

Phòng rửa và cất nước - Máy cất nước 1 lần - Máy cất nước 2 lần b. Phòng hấp – sấy - Autoclave - Tủ sấy 60 – 200oC c. Phòng chuẩn bị môi trường - Cân phân tích (chính xác đến 0,0001 g) - Cân kỹ thuật (chính xác đến 0,01 g) - pH kế - Máy khuấy từ - Tủ lạnh - Lò vi sóng (microwave) d. Phòng thao tác nuôi cấy - Tủ cấy vô trùng (laminar) - Quạt thông gió - Đèn tử ngoại treo tường e. Phòng nuôi cây - Các giàn kệ có...
Nội dung trích xuất từ tài liệu:
THỰC HÀNH VỀ NUÔI CẤY MÔ THỰC VẬT Trường Đại Học Nguyễn Tất Thành Khoa Công Nghệ Sinh Học THỰC HÀNHNUÔI CẤY MÔ THỰC VẬT Biên soạn Th.S MAI THỊ PHƯƠNG HOA Th.S ĐỖ TIẾN VINH Tháng 04/2012 Thực hành nuôi cấy mô thực vật BÀI 1 MỞ ĐẦU1. CÁC THIẾT BỊ CƠ BẢN CỦA MỘT PHÒNG THÍ NGHIỆMNUÔI CẤY MÔ VÀ TẾ BÀO THỰC VẬT a. Phòng rửa và cất nước - Máy cất nước 1 lần - Máy cất nước 2 lần b. Phòng hấp – sấy - Autoclave - Tủ sấy 60 – 200oC c. Phòng chuẩn bị môi trường - Cân phân tích (chính xác đến 0,0001 g) - Cân kỹ thuật (chính xác đến 0,01 g) - pH kế - Máy khuấy từ - Tủ lạnh - Lò vi sóng (microwave) d. Phòng thao tác nuôi cấy - Tủ cấy vô trùng (laminar) - Quạt thông gió - Đèn tử ngoại treo tường e. Phòng nuôi cây - Các giàn kệ có gắn đèn huỳnh quang - Máy điều hòa nhiệt độ - Máy lắc nằm ngang - Tủ ấm f. Phòng thí nghiệm (phòng này dùng để tiến hành các phân tích sinh hóa, phân tử và ditruyền) - Kính hiển vi 2 mắt (độ phóng đại 1000 lần) - Kính lúp 2 mắt (độ phóng đại 75 lần) - Microtome - Máy ảnh kỹ thuật số - Hệ thống đèn chiếu - Quang phổ kế … 1 Thực hành nuôi cấy mô thực vật2. CÁC NHÂN TỐ ĐẢM BẢO THÀNH CÔNG TRONG NUÔI CẤYMÔ TẾ BÀO THỰC VẬT Có 3 nhân tố chính: - Bảo đảm điều kiện vô trùng - Chọn đúng môi trường và chuẩn bị môi trường đúng cách - Chọn mô cấy và xử lý mô cấy thích hợp trước và sau khi cấy.2.1. Ý nghĩa của vô trùng trong nuôi cấy mô và tế bào thực vật Môi trường để nuôi cấy mô và tế bào thực vật có chứa đường, vitamin,muối khoáng… rất thích hợp cho các loại nấm và vi khuẩn phát triển. Dotốc độ phân bào của nấm và vi khuẩn lớn hơn rất nhiều so với tế bào thựcvật, nếu trong môi trường nuôi cấy chỉ nhiễm một vài bào tử nấm hoặc vikhuẩn thì chỉ sau vài ngày đến một tuần, toàn bộ bề mặt môi trường và mônuôi cấy sẽ phủ đầy một hoặc nhiều loại nấm và vi khuẩn. Thí nghiệm phảibỏ đi vì trong điều kiện này mô nuôi cấy sẽ không phát triển và chết dần.2.2 Nguồn tạp nhiễm Có 3 nguồn tạp nhiễm chính: - Dụng cụ thuỷ tinh, môi trường nuôi cấy và nút đậy không được vôtrùng tuyệt đối - Trên bề mặt hoặc bên trong mô cấy tồn tại các sợi nấm, bào tử nấmhoặc vi khuẩn - Trong quá trình thao tác làm rơi nấm hoặc vi khuẩn theo bụi lên bềmặt môi trường2.3 Kỹ thuật vô trùng2.3.1 Vô trùng dụng cụ thuỷ tinh, nút đậy và môi trường a. Dụng cụ thuỷ tinh Thông thường các dụng cụ thuỷ tinh dùng trong các thí nghiệmthường được xử lý bằng dung dịch sulfocromate một lần đầu trước khi đưavào sử dụng; về sau chỉ cần rửa sạch bằng xà phòng, tráng sạch bằng nướccất và để thật ráo trước khi sử dụng. Trong trường hợp các dụng cụ thuỷ tinh dùng trong các thí nghiệmnuôi cấy mô và tế bào thực vật đòi hỏi vô trùng, có thể khử trùng trong tủsấy ở nhiệt độ cao trong nhiều phút hoặc nhiều giờ. Các dụng cụ này luônđược gói trong giấy nhôm hoặc hộp kim loại để tránh bị nhiễm trở lại saukhi đã khử trùng. b. Nút đậy Thường dùng nhất là các nút đậy làm bằng bông gòn không thấm nước.Nút phải tương đối chặt để đảm bảo bụi không đi qua được, đồng thời nướctừ môi trường không bị bốc hơi quá dễ dàng trong quá trình nuôi cấy. Bôngkhông thấm nước là loại nút đơn giản nhất nhưng có các nhược điểm sau: 2 Thực hành nuôi cấy mô thực vật - Nếu khi hấp nút bông bị ướt hoặc dính môi trường thì về sau sẽ rấtdễ bị nhiễm nấm, nhất là với những thí nghiệm tiến hành trong một thờigian dài. - Thao tác làm nút bông chậm, không thuận tiện khi nuôi cấy trên quymô lớn. Chỉ dùng được vài lần là phải bỏ Hiện nay người ta sử dụng nhiều loại nắp đậy khác thay thế nút bông.Các hãng sản xuất dụng cụ nuôi cấy mô cung cấp loại nắp ống nghiệm vàbình tam giác bằng nhựa chịu nhiệt có thể hấp vô trùng ở nhiệt độ 121°Cmà không bị biến dạng. Một số phòng thí nghiệm dùng nắp ống nghiệmbằng inox hoặc cao su rất thuận tiện cho việc vô trùng khô hoặc ướt. Cũngcó thể sử dụng giấy nhôm để làm nắp đậy… c. Môi trường Môi trường nuôi cấy thường được hấp khử trùng trong nồi hấp(autoclave), khử trùng bằng áp suất hơi nước bão hòa. Thời gian hấp từ 15 -30 phút ở áp suất hơi nước bão hòa là 103,4 kPa (1atm) tương đương vớinhiệt độ 121°C. Ở nhiệt độ 121°C, hầu hết các sinh vật có trong môi trườngđều bị tiêu diệt, kể cả ở dạng bào tử. Sau khi vô trùng cần phải làm khô nắpống nghiệm hoặc nút bông để tránh bị nhiễm trở lại. Thời gian khử trùng dung dịch và các môi trường lỏng bằng nồi hấp(autoclave) ở 1210C tại 103,4 kPa Thể tích môi trường (mL) Thời gian hấp khử trùng (phút) Thực hành nuôi cấy mô thực vậtkích thước lỗ 0,25 µm) trên đế, đặt vòng cao su lên và vặn chặt nắp vào đế.Gói toàn bộ bộ lọc vào trong một tờ giấy nhôm và khử trùng trong autoclaveở 121°C trong 15 - 20 phút. Đồng thời cũng hấp vô trùng một bình huỷ tinhđể hứng dịch lọc. Dùng ống tiêm hút dịch lọc và bơm qua bộ lọc.2.3.2 Khử trùng mô thực vật Mô cấy có thể là hầu hết các bộ phận khác nhau của thực vật như hạtgiống, phôi, noãn, đế hoa, lá, đầu rễ, thân củ…tuỳ theo sự tiếp xúc với môitrường bên ngoài, các bộ phận này chứa nhiều hay ít vi khuẩn và nấm.Đòng lúa non khi còn trong bẹ, mô thịt bên trong quả… thường ít bị nhiễmvi sinh vật; ngược lại, lá, thân đặc biệt ở các bộ phận nằm sâu trong đất nhưrễ, củ… có lượng nấm, khuẩn tạp rất cao. Hầu như không thể vô trùng m ...