Xác định sinh trưởng của tế bào

Xác định sinh trưởng của tế bào Trong các hệ thống sinh học, mọi sự sinh trưởng đều có thể được định nghĩa là sự tăng tuần tự của các thành phần hóa học. Sự sinh trưởng của tế bào có thể được xác định bằng số lượng tế bào, sinh khối tế bào hoặc hoạt tính tế bào. 1. Xác định số lượng tế bào 1.1. Đếm bằng kính hiển vi Số lượng tế bào trong quần lạc có thể được đếm dưới kính hiển vi bằng cách đếm các tế bào được đưa vào trong một buồng đếm...
Nội dung trích xuất từ tài liệu:
Xác định sinh trưởng của tế bào Xác định sinh trưởng của tế bàoTrong các hệ thống sinh học, mọi sự sinh trưởng đều có thể được định nghĩalà sự tăng tuần tự của các thành phần hóa học. Sự sinh trưởng của tế bào cóthể được xác định bằng số lượng tế bào, sinh khối tế bào hoặc hoạt tính tếbào.1. Xác định số lượng tế bào1.1. Đếm bằng kính hiển viSố lượng tế bào trong quần lạc có thể được đếm dưới kính hiển vi bằng cáchđếm các tế bào được đưa vào trong một buồng đếm đặc biệt. Có hai loạibuồng đếm được dùng để đếm số lượng tế bào trong một mẫu dịch lỏng: - Haemocytomete. Buồng đếm tế bào máu dùng cho những tế bào có đường kính ≥ 3 µm. - Petroff-Hausser counting chamber. Buồng đếm Petroff- Hausser được dùng chủ yếu cho vi khuẩn.Cả hai loại buồng đếm có các đường kẻ ô vuông đặc trưng trên bề mặt củatấm kính (lam kính). Khung đỡ trên mỗi mặt của tấm đếm (grid) giữ một tấmkính phủ (cover glass) cách tấm đếm một khoảng cách đã biết (ví dụ: 0,1mm) sao cho thể tích của ô vuông được biết chính xác. Một mẫu dịch huyềnphù tế bào cần đếm được cho chảy qua dưới tấm phủ và làm đầy buồng đếm.Sau đó, đếm số lượng tế bào trên một đơn vị diện tích của đường kẻ dướikính hiển vi. Các dịch huyền phù đậm đặc cũng có thể đếm được nếu chúngđược pha loãng thích hợp.Một số ưu điểm của phương pháp đếm trực tiếp: - Chỉ cần các thiết bị tối thiểu. - Các kết quả thu được nhanh. - Có thể quan sát các đặc điểm hình thái của cơ thể Buồng đếm haemocytometerMột số nhược điểm của phương pháp đếm trực tiếp: - Thường rất khó phân biệt các tế bào chết và tế bào sống. - Không thích hợp cho các dịch huyền phù có mật độ thấp. - Các tế bào có kích thước nhỏ thường khó quan sát dưới kính hiển vi và có thể không thấy khi đếm. - Phương pháp đếm thực tế gây mỏi mệt và nhầm lẫn trong quá trình đếm. - Không thích hợp đối với các tế bào xếp thành cụm như là mycelium (thể sợi nấm).1.2. Đếm các tế bào phát triển trên đĩa nuôi cấy (petri dish)Các tế bào phát triển được định nghĩa là tế bào có thể phân chia và tạo rakhuẩn lạc. Có hai cách để thực hiện phương pháp đếm trên đĩa petri: phươngpháp đĩa trải (spread plate) và phương pháp đĩa rót (pour plate).Với phương pháp đĩa trải, một thể tích nhỏ hơn 100 µL được trải khắp bề mặtagar. Với phương pháp đĩa rót, mẫu vật được trộn với agar nóng chảy (đã đểnguội đến khoảng 60oC) và được rót trên đĩa vô trùng. Các đĩa sau đó đượcnuôi cho đến khi xuất hiện khuẩn lạc, và số lượng khuẩn lạc được đếm trựctiếp. Điều quan trọng là số lượng các khuẩn lạc phát triển trên đĩa phải khôngquá lớn hoặc không quá nhỏ. Để thu được một số lượng tế bào thích hợp trênmột đơn vị diện tích thì mẫu vật phải được pha loãng. Trường hợp cần phaloãng nhiều, người ta thường sử dụng kỹ thuật pha loãng tuần tự (serialdilution). Ví dụ: để thực hiện pha loãng 1/106, thì có thể thực hiện ba lần phaloãng liên tiếp 1/100 hoặc sáu lần pha loãng liên tiếp 1/10.1.3. Đếm bằng máy đếmĐể tránh sự đơn điệu khi đếm trực tiếp bằng kính hiển vi, có thể sử dụngphương pháp đếm bằng máy đếm. Kỹ thuật này cho phép không chỉ đếmđược số lượng tế bào, mà còn đo cả kích thước tế bào. Nhược điểm củaphương pháp này là nó không thể phân biệt giữa tế bào và các phần tử bẩnkhác. Kỹ thuật này cũng khó sử dụng với các cơ thể dạng chuỗi và khôngđem lại kết quả tốt với các cơ thể dạng hệ sợi (ví dụ như nấm).2. Xác định sinh khối tế bào2.1. Trọng lượng khô của tế bàoTrọng lượng khô tế bào có thể được xác định trực tiếp bằng cách lấy mộtlượng tối thiểu của dịch huyền phù tế bào để ly tâm. Sau khi đổ thể nổi, tếbào được rửa bằng nước cất để loại bỏ tất cả các chất hòa tan. Dịch huyềnphù được ly tâm một lần nữa và các tế bào sau khi kết đặc lại được sấy khôtrong tủ sấy và cân để xác định trọng lượng. Đây là phương thức trực tiếpnhất để xác định số lượng sinh khối tế bào. Tuy nhiên, cách xác định như thếtốn nhiều thời gian và dễ bỏ qua những thay đổi nhỏ của sinh khối tế bào. Kỹthuật này chỉ có thể sử dụng đối với những dịch huyền phù dày đặc và tế bàophải được rửa sạch hoàn toàn khỏi những chất ngoại sinh bám vào.2.2. Độ đục của dịch huyền phù tế bàoSinh khối tế bào cũng có thể được xác định bằng phương pháp quang họcthông qua xác định lượng ánh sáng bị tán xạ bởi dịch huyền phù tế bào. Kỹthuật này dựa trên cơ sở lập luận rằng các phần tử nhỏ tán xạ ánh sáng mộtcách tương xứng, trong các giới hạn nhất định, tới nồng độ của chúng. Khi tiasáng xuyên qua dịch huyền phù của tế bào, thì lượng ánh sáng truyền qua bịgiảm đi do kết quả của sự tán xạ, như vậy đó chính là phương pháp xác địnhmật độ tế bào.Việc đo độ đục của dịch huyền phù tế bào thường được thực hiện trên máyquang phổ để đọc các đơn vị hấp thụ (A). Khả năng hấp thụ (absorbency)được định nghĩa là số logarithm của tỷ lệ giữa cường độ ánh sáng va chạmvào dịch huyền phù tế bào (Io) và cường độ ánh sáng được truyền qua bởidịch huyền phù (I): A = log Io/IĐường cong chuẩn (standard curve) có thể thu được bằng cách đo độ hấp thụ(A) của mẫu với nồng độ tế bào đã biết trước. Việc đo thường được thực hiệnở bước sóng từ 600-700 nm.3. Các phương pháp gián tiếpPhương pháp gián tiếp để xác định sinh khối tế bào dựa trên phép tính hệ sốtỷ lượng toàn phần (overall stoichiometry) cho sự sinh trưởng và tạo thànhsản phẩm, có thể được trình bày trong một dạng chung như sau:Nguồn carbon + nguồn nitrogen + phosphate + O2 → sinh khối tế bào + CO2+ H2O + sản phẩm + nhiệtSự thay đổi sinh khối tế bào có thể được kiểm soát gián tiếp bằng cách xácđịnh sự tiêu thụ chất dinh dưỡng, tạo thành sản phẩm, các thành phần tế bào,giải phó ...