Báo cáo y khoa: ứNG DụNG Kỹ THUậT RT -PCR PHáT HIệN VIRUt CHIKUNGUNYA ở BệNH NHÂN sốt xuất huyết

Gần đây, virut Chikungunya (CHIKV) là một nguyên nhân gây ra dịch sốt xuất huyết (SXH) ở các n-ớc Đông Nam á và châu Phi. Mặc dù, xét nghiệm huyết thanh học có thể phát hiện nh-ng việc phát hiện CHIK-ARN trong mẫu bệnh phẩm vẫn cần đ-ợc phát triển, cải thiện. Nghiên cứu này, mô tả kỹ thuật RT-PCR khuếch đại gen E1 của virut dùng chẩn đoán CHIKV-ARN. Bằng kỹ thuật này phát hiện 4/50 (8%) bệnh nhân (BN) SXH d-ơng tính với CHIKV-ARN. Phân tích trình tự gen 4 mẫu này xác định độ t-ơng đồng các...
Nội dung trích xuất từ tài liệu:
Báo cáo y khoa: "ứNG DụNG Kỹ THUậT RT -PCR PHáT HIệN VIRUt CHIKUNGUNYA ở BệNH NHÂN sốt xuất huyết"øNG DôNG Kü THUËT RT -PCR PH¸T HIÖN VIRUt CHIKUNGUNYA ë BÖNH NH¢N sèt xuÊt huyÕt NguyÔn Träng ViÔn*; Vò Xu©n NghÜa*; NguyÔn LÜnh Toµn *; TrÇn ViÕt TiÕn**; L−¬ng Cao §ång**Tãm t¾t GÇn ®©y, virut Chikungunya (CHIKV) lµ mét nguyªn nh©n g©y ra dÞch sèt xuÊt huyÕt (SXH) ë c¸cn−íc §«ng Nam ¸ vµ ch©u Phi. MÆc dï, xÐt nghiÖm huyÕt thanh häc cã thÓ ph¸t hiÖn nh−ng viÖcph¸t hiÖn CHIK-ARN trong mÉu bÖnh phÈm vÉn cÇn ®−îc ph¸t triÓn, c¶i thiÖn. Nghiªn cøu nµy, m«t¶ kü thuËt RT-PCR khuÕch ®¹i gen E1 cña virut dïng chÈn ®o¸n CHIKV-ARN. B»ng kü thuËt nµyph¸t hiÖn 4/50 (8%) bÖnh nh©n (BN) SXH d−¬ng tÝnh víi CHIKV-ARN. Ph©n tÝch tr×nh tù gen 4 mÉunµy x¸c ®Þnh ®é t−¬ng ®ång c¸c nucleotide trªn 93% so víi c¸c chñng CHIKV ®· c«ng bè. * Tõ khãa: Sèt xuÊt huyÕt; Chikungunya. APPLYING THE RT-PCR ASSAY TO IDENTIFY CHIKUNGUNYA VIRUS IN HEMORRHAGIC FEVER PATIENTSSummary Chikungunya virus (CHIKV) has recently caused hemorrhagic fever in Southeast Asian andAfrican countries. Although serological test may be used, however, to examine CHIKV-RNA insample still need to improvement. In this study, we have descried a revert transcript (RT)-PCR assaytargeting E1 gene of virus for diagnosis of CHIKV-RNA. In 4/50 (8%) blood samples of hemorrhagicfever patients were positive sample for CHIKV-RNA by RT-PCR assay. Sequencing analyzed for 4sample patients demonstrated more than 93% homological nucleotides. * Key words: Hemorrhagic fever; Chikungunya. cã cÊu tróc ARN ®¬n, kÝch th−íc kho¶ng §Æt vÊn ®Ò 12 kb, capsid vµ protein mµng. CHIKV lÇn Virut Chikungunya (CHIKV) thuéc nhãm ®Çu tiªn ®−îc ph¸t hiÖn ë Tanzania (Ch©uAlphavirus, hä Togaviridae. CHIKV g©y c¸c Phi). Sau ®ã, virut ph¸t triÓn g©y dÞch ëtriÖu chøng l©m sµng ®iÓn h×nh nh− ®au nhiÒu n−íc vµ c¸c khu vùc trªn thÕ giíi.khíp, sèt vµ xuÊt huyÕt. Nh÷ng triÖu chøng GÇn ®©y, CHIKV g©y ra c¸c vô dÞch lín ë Ênl©m sµng nµy còng th−êng thÊy trªn bÖnh §é, Singapore, Th¸i lan, Indonesia vµ ®Æcnh©n nhiÔm virut Onyong-nyong, Virut Ross biÖt ë Italia, mét n−íc thuéc Ch©u ¢u cã khÝRiver, Virut Barmah Forest vµ ®Æc biÖt ë c¸c hËu «n hßa. Trong nghiªn cøu nµy, chóng t«i øng dông kü thuËt revert transcript (RT)-n−íc §«ng Nam ch©u ¸ vµ ch©u Phi th−êng PCR ®Ó ph¸t hiÖn CHIKV trªn BN SXH.gièng víi dengue xuÊt huyÕt. CHIKV lµ virut* Häc viÖn Qu©n y** BÖnh viÖn 103Ph¶n biÖn khoa häc: TS. NguyÔn §Æng Dòng §èi t−îng vµ ph−¬ng ph¸p nghiªn cøu ACCGGCGTCTACCC-ATTTATGTG-3 vµ 1. §èi t−îng nghiªn cøu. E1R: 5-AGGGCGGGTAGTCCATGTTG-3 Nghiªn cøu sö dông huyÕt thanh cña (331bp) dùa trªn CHIKV chñng S2750 BN chÈn ®o¸n SXH ë giai ®o¹n sím (AF490259). CÆp måi cña DENV lµ D1 5-trong vô dÞch SXH n¨m 2009 nhËp viÖn t¹i TCAATATGCTGAAACGCGC-3 vµ D2 5-BÖnh viÖn 103 vµ Tr¹m x¸ x· T¶ Thanh Oai, TGCACCAACAGTCAATGT-3 (511bp) theoThanh Tr× Hµ Néi. BÖnh nh©n nhËp viÖn vµ tr×nh tù nucleotid cña DENV týp II ®· c«ng bè.Trung t©m y tÕ víi biÓu hiÖn sèt ®ét ngét 38 * T¸ch chiÕt ARN: t¸ch vµ tinh s¹ch ARN- 39 0C (hÕt sèt ë ngµy thø 6 - 7), niªm m¹c cña virut ®−îc tõ 150 micro huyÕt t−¬ng,m¾t ®á, kÕt m¹c xung huyÕt, nèt xuÊt huyÕt dïng kit cña h·ng Qiagen (Qiagen ARNtù nhiªn d−íi da, nhiÒu ë c¼ng tay vµ ®ïi, Blood mini kit) theo qui tr×nh cña nhµ s¶nnhiÒu bÖnh nh©n cã ®au c¬, khíp. Gan to xuÊt (Qiagen, §øc). ARN thu ®−îc th−êng2 - 3 cm d−íi bê s−ên, mËt ®é mÒm. sö dông ngay cho ph¶n øng RT-PCR hoÆc cÊt gi÷ ë -800C ®Õn khi sö dông. 2. Ph−¬ng ph¸p nghiªn cøu. * Plasmid t¸i tæ hîp: * Quy tr×nh ph¶n øng RT-PCR: thùc hiÖn ph¶n øng RT-PCR theo h−íng dÉn cña nhµ Plasmid mang toµn bé ®o¹n gen m· ho¸ s¶n xuÊt víi mét sè thay ®æi ®Ó tèi −u hãacho protein mµng E1 cña CHIKV ®−îc t¸ch ®iÒu kiÖn ph¶n øng. Thµnh phÇn tham giadßng (cloning) vµo vector pGOV4, sö dông ph¶n øng RT-PCR bao gåm: 5x Qiagenlµm chøng d−¬ng cho ph¶n øng RT – PCR Onestep RT-PCR buffer x 5l, dNTP 10 mM/lph¸t hiÖn CHIKV huyÕt thanh. §©y lµ plasmid x 0, 4l, cÆp måi ph¸t hiÖn CHIKV vµ DENVnhËn tõ Malaysia theo ch−¬ng tr×nh hîp t¸c 10 pmol/l x 1l (mçi primer), enzyme taq-nghiªn cøu. Chóng ©m cho ph¶n øng RT- polymerase x 2,5U, ARN cña virut vµ n−ícPCR, sö dông cïng thÓ tÝch n−íc khö ion. khö ion ARNfree võa ®ñ 50 microl. Chu tr×nhChøng d−¬ng cña DENV lµ vector pGEMT nhiÖt thùc hiÖn ë 450C trong 45 phót chochøa cña DENV ®−îc thiÕt kÕ chÕ t¹o t¹i chuyÓn ®æi tõ ARN sang cADN. TiÕp ®Õn lµTrung t©m Y Dinh D−îc häc Häc viÖn Qu©n y. 950C trong 2 phót vµ 40 vßng cña c¸c giaiQu¸ tr× ...