Biểu hiện gen HA5.1 được cải biến mã có hoạt tính sinh học trong nấm men Pichia pastoris X33

Trong nghiên cứu này, với mục đích thu được HA5.1 tái tổ hợp có hoạt tính HA cao dùng để chế vaccine phòng cúm A/H5N1 cho gia cầm chúng tôi tiến hành tối ưu mã bộ ba và biểu hiện gen mã hoá cho kháng nguyên HA5.1 của virus cúm A/H5N1 trong P. pastoris X33.
Nội dung trích xuất từ tài liệu:
Biểu hiện gen HA5.1 được cải biến mã có hoạt tính sinh học trong nấm men Pichia pastoris X33TẠP CHÍ SINH HỌC, 2013, 35(2): 255-264BIỂU HIỆN GEN HA5.1 ĐƯỢC CẢI BIẾN MÃ CÓ HOẠT TÍNH SINH HỌCTRONG NẤM MEN PICHIA PASTORIS X33Võ Viết Cường1, Lê Thị Huệ2, Đỗ Thị Huyền2*, Lê Quỳnh Giang2,Nguyễn Thị Quý2, Trương Nam Hải212Trung tâm nhiệt đới Việt-NgaViện Công nghệ sinh học, Viện Hàn lâm KH & CN Việt Nam, *dohuyen@ibt.ac.vnTÓM TẮT: Bên cạnh ảnh hưởng của điều kiện lên men và promotor thì mức độ biểu hiện protein ngoạilai trong Pichia pastoris còn phụ thuộc các yếu tố liên quan đến quá trình phiên mã và dịch mã như: chỉ sốphù hợp gen ngoại lai với chủng biểu hiện; sự ưu tiên sử dụng các mã bộ ba của P. pastoris; hàm lượngGC và sự phân bố GC dọc theo gen. Để thu được tiểu phần HA1 (HA5.1) của kháng nguyênhemagglutinin H5 có hoạt tính sinh học làm cơ sở cho việc tạo vaccine phòng cúm A/H5N1 cho gia cầm,chúng tôi tiến hành tối ưu mã bộ ba gen ha5.1 có kích thước 1 kb của virus cúm A/H5N1 phù hợp với hệbiểu hiện nấm men P. pastoris X33. Gen sau khi được cải biến (mha5.1) có CAI đạt 0,98, hàm lượngtrung bình GC từ 41,93 giảm xuống 36,64%. Tần suất sử dụng các mã bộ ba ở mức phù hợp 91-100% tăngmạnh từ 44% trước cải biến lên 94% và không còn các mã bộ ba hiếm. Sau khi tối ưu mã bộ ba, genmha5.1 được ghép nối vector pPICZαmha 5.1 và nhân dòng trong E. coli DH10b. Vector pPICZαmha5.1sau đó được biến nạp vào nấm men P. pastoris X33. Protein tái tổ hợp MHA5.1 được tổng hợp dưới sựđiều khiển của promotor AOX1 có kích thước 50-70 kDa và tiết ra ngoài môi trường sau 72 giờ nuôi cấy,nhiệt độ 30oC, pH môi trường cảm ứng 6,7 đến 7,2, với chất cảm ứng 1% methanol. HA5.1 tái tổ hợp liênkết đặc hiệu với kháng thể thỏ kháng virus cúm A/H5N1 và có hoạt tính ngưng kết hồng cầu gà ở độ phaloãng mẫu 26.Từ khóa: Chỉ số phù hợp mã bộ ba, cúm gia cầm A/H5N1, P. pastoris X33, pPICZαmha5.1 protein HA5.1tái tổ hợp.MỞ ĐẦUP. pastoris là một trong những hệ biểu hiệneukaryote được sử dụng rộng rãi trong nghiêncứu biểu hiện các protein ngoại lai, đặc biệt làcác gen mã hóa protein có bản chất glycoproteindo có quá trình cải biến sau dịch mã nhưphosphoryl hóa, acetyl hóa, glycosyl hóa kháhoàn thiện. Protein biểu hiện được tiết ra môitrường với hàm lượng lớn, có tính ổn định caovà giữ nguyên hoạt tính sinh học [2, 10]. Mộttrong những vấn đề cần xem xét trước khi biểuhiện gen ngoại lai không chỉ đối với P. pastorismà với mọi hệ biểu hiện là cân bằng tỷ lệ sửdụng mã bộ ba gen ngoại lai với chủng biểuhiện; điều chỉnh hàm lượng GC, sự phân bố GCdọc theo chiều dài của gen; sự phân bố tỷ lệ mãbộ ba [5, 7].Trong quá trình tiến hóa, các loài khác nhaucó tính thiên vị với một loại mã bộ ba nhất địnhtrong số các mã bộ ba đồng nghĩa cùng mã hóacho một axit amin. Do đó có thể mã bộ ba đượcưu tiên sử dụng ở loài này nhưng lại trở thànhmã bộ ba hiếm ở loài khác. Tần suất sử dụng bộba AGG, AGA mã hoá cho Arg ở người là11,2%, trong khi đó, giá trị này ở E. coli là2,1% và 2,4%. Ngược lại E. coli chủ yếu sửdụng bộ ba CGT để mã hoá cho Arg với tầnsuất 16,4% [5]. Hàm lượng GC cao và phân bốkhông đều dễ tạo cấu trúc thứ cấp, như cấu trúckẹp tóc. Cấu trúc thứ cấp được hình thành haymất đi gần vùng mRNA không dịch mã và gầnmã bộ ba khởi đầu có ảnh hưởng đến tốc độ suythoái mRNA và ảnh hưởng tới khởi đầu dịch mã[1, 4].Hemagglutinin (HA) của virus cúm A làmột kháng nguyên bề mặt quan trọng, có bảnchất là glycoprotein. HA đóng vai trò quantrọng trong quá trình xâm nhiễm vào tế bào chủcủa virus. Kháng nguyên HA được xem là thànhphần quyết định để tạo vaccine. Kết quả cácnghiên cứu cho thấy, phần lớn sự bảo hộ chốnglại virus cúm A là kết quả của đáp ứng miễndịch kháng lại kháng nguyên HA, đặc biệt làtiểu phần HA1. Sealens et al. (1999) [11] đãbiểu hiện gen HA từ chủng virus cúm A/H3N2255Vo Viet Cuong et al.trong nấm men P. pastoris, HA tái tổ hợp đượctiết ra môi trường nuôi cấy và có khả năng bảovệ chuột khi công độc với liều 10 x LD50 chủngcúm A/H3N2. Có nhiều công trình nghiên cứutối ưu mã bộ ba biểu hiện gen HA làm vaccinephòng cúm. Kết quả nghiên cứu của Chen et al.(2008) [3] cho thấy HA type dại không biểuhiện protein tốt trong tế bào 293 T của chuột,lượng mRNA thấp trong tế bào chất và dịch mãkhông hiệu quả do các sai khác trong sử dụngmã bộ ba. Sau cải biến các mã bộ ba làm tănghàm lượng GC từ 42% lên 58% để phù hợp vớihệ biểu hiện tế bào động vật có vú, mRNA tổnghợp có tính ổn định cao, được chế biến và xuấttừ nhân ra tế bào chất tốt hơn, vaccine cung cấpmiễn dịch bảo hộ hiệu quả ở chuột với chủngvirus H5N1. Trong nghiên cứu này, với mụcđích thu được HA5.1 tái tổ hợp có hoạt tính HAcao dùng để chế vaccine phòng cúm A/H5N1cho gia cầm chúng tôi tiến hành tối ưu mã bộ bavà biểu hiện gen mã hoá cho kháng nguyênHA5.1 của virus cúm A/H5N1 trong P. pastorisX33.VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨUVật liệuVi khuẩn E. coli DH10b [F-gyrA462 ...