Luận văn Thạc sĩ Khoa học: Nghiên cứu xây dựng quy trình phát hiện nhanh virus cúm gia cầm A/H5N1 trong mẫu bệnh phẩm bằng kỹ thuật Multiplex Reverse Transcription Polymerase Chain Reaction

Mục tiêu của luận văn nhằm thiết kế và lựa chọn được các mồi phù hợp để thực hiện phản ứng multiplex RT-PCR phát hiện virus cúm A/H5N1; nghiên cứu tối ưu hóa được các điều kiện của phản ứng multiplex RT-PCR: nhiệt độ và thời gian gắn mồi, nồng độ mồi,...; thử nghiệm được phản ứng multiplex RT-PCR phát hiện A/H5N1 trên một số mẫu bệnh phẩm thu thập từ người và gia cầm.
Nội dung trích xuất từ tài liệu:
Luận văn Thạc sĩ Khoa học: Nghiên cứu xây dựng quy trình phát hiện nhanh virus cúm gia cầm A/H5N1 trong mẫu bệnh phẩm bằng kỹ thuật Multiplex Reverse Transcription Polymerase Chain Reaction MỞĐẦU Trongnhữngnămgần đây,dịchcúmgiacầmdovirusA/H5N1làvấn đềquantâmđốivớicảthếgiới,đặcbiệtlàđốivớicácnướcchâuÁnhưViệtNam,Indonesia, Thái Lan, Trung Quốc... Kể từ cuối năm 2003 đến nay, dịch cúmA/H5N1đãgâythiệthạirấtlớnchongànhchănnuôigiacầmvàgâytửvongchohàngtrămngười.Cả thế giới đanglosợ trướcnguycơ cóthể xảyramột đạidịchcúmtrênngườidovirusA/H5N1giốngnhưcácvụđạidịchcúmđãxảyratrongthếkỷ20.CácnướctrênthếgiớiđãtiêutốnhàngtỷđôlachoviệcchuẩnbịchốnglạimộtđạidịchcúmH5N1cóthểxảyratrongtươnglainhưmuathuốcvàcácthiếtbịytế,nghiêncứusảnxuấtvaccine,thựchànhcácphươngánphòngchốngdịch, thực hiện các chiến lược nhằm kiểmsoát chặtchẽ đườngbiêngiới... ỞViệtNam,kểtừnăm2003đếnnay,dịchcúmgiacầmliêntụcxảyraởhầuhếtcáctỉnhthànhtrêntoànquốc.Mỗinămcóhàngtriệugiacầmbịchếtvàtiêuhủy.TheothốngkêcủaTổchứcYtếThếgiới,ViệtNamđangđứngthứ2trênthếgiới(sauIndonesia)vềsốngườinhiễmvàtửvongdovirusA/H5N1. ViruscúmA/H5N1làviruscókhảnăngbiếnđổigennhanhchóngvàhìnhthànhnêncácchủngvirusmớinênviệcsử dụngvaccine để dự phòngthườngkhôngđạtđượchiệuquảcao.ỞViệtNamhiệnnay,dịchcúmA/H5N1vẫnliêntụcxảyratrêngiacầmvàngười,mặcdùmức độ khôngtrầmtrọngnhư giaiđoạntrướcđâynhưngnếukhôngđượcpháthiệnvàcócácbiệnphápdậpdịchkịpthờithìdịchcóthểtrởnênbùngphát. Khicódịchcúmgiacầm,mộtphươngphápchẩnđoánnhanh,nhạyvàchính xáclàcầnthiếtchoviệcđiềutrị,kiểmsoátvàngănchặnkịpthờitránhlâylanrộngracộngđồng.ĐểpháthiệnviruscúmA/H5N1trongcácmẫubệnhphẩmởngườivàgiacầm,hiệnnayhầuhếtcácphòngxétnghiệmđềuápdụngkỹthuậtRTPCR(ReverseTranscriptionPolymeraseChainReaction). Đâylàkỹ thuật 1sinhhọcphântử,chophéppháthiệnvirusvớiđộchínhxáccao,thờigianlàmxétnghiệmkhoảng46giờ nếuthựchiệnRealtimeRTPCRvà1224giờ nếuthựchiệnRTPCRvà điệnditrêngelagarose.VớiRTPCRthôngthường,ng ườitaphảithựchiệnbaphảnứngđểchẩnđoánxácđịnhviruscúmA/H5N1,baogồm:mộtphảnứngđểxácđịnhviruscúmA,mộtphảnứngxácđịnhsubtypeH5vàmộtphảnứngxác địnhsubtypeN1. Để đơngiảnhóaquátrìnhxétnghiệm,rútngắnthờigianxétnghiệmvàtiếtkiệmchiphíngườitacóthể ứngdụngkỹthuậtmultiplexRTPCR,chophépchẩnđoánxácđịnhcúmA/H5N1chỉvớimộtphảnứngRTPCRthayvìphảilàmbaphảnứngRTPCR.Tuynhiên,việcnghiêncứuthiếtkế vàxâydựngquytrìnhthựchiệnkỹ thuậtmultiplexRTPCRkháphứctạpnênhiệnnayhầuhếtcácphòngxétnghiệmtrongnướcchưaápdụngkỹ thuậtnàytrongchẩn đoáncúmA/H5N1.Chínhvìvậy,chúngtôithựchiện”NghiêncứuxâydựngquytrìnhpháthiệnnhanhviruscúmgiacầmA/H5N1 trong mẫu bệnh phẩm bằng kỹ thuật Multiplex Reverse Transcription PolymeraseChainReaction” tạiLaboTrường ĐạihọcYTháiBìnhvớimụctiêu: 1. Thiết kế và lựa chọn được các mồi phù hợp để thực hiện phản ứng multiplexRTPCRpháthiệnviruscúmA/H5N1. 2. Nghiêncứutối ưuhóađượccác điềukiệncủaphản ứngmultiplexRT PCR:nhiệtđộvàthờigiangắnmồi,nồngđộmồi,... 3. Thử nghiệmđượcphản ứngmultiplexRTPCRpháthiệnA/H5N1trên mộtsốmẫubệnhphẩmthuthậptừngườivàgiacầm. 2Chương1.TỔNGQUAN1.1.ĐẠICƯƠNGVỀVIRUSCÚMA/H5N11.1.1.Phânloạihọcvàdanhpháp 1.1.1.1.Phânloạiviruscúm TheoủybanQuốctếvềphânloạivirus(ICTVInternationalCommitteeonTaxonomyofViruses),viruscúmthuộcnhómV,họ Orthormyxoviridae,gồm3typelàA,BvàC.ChúnglàcácviruscóvậtliệuditruyềnlàRNAsợiđơnâm[32]. SựphânbiệtviruscúmA,BvàCdựatrênsựkhácnhauvề đặctínhkhángnguyêncủanucleoprotein(NP)vàproteinnềnM1(matrixprotein).Ngoàira,hệgencủaviruscúmAvàB đềucó8đoạnRNAcònviruscúmCchỉ có7đoạnRNA[36]. Trong3typethìtypeAlàviruscógiớihạnvậtchủrấtrộng,lưuhànhphổbiếntrêngiacầmvàmộtsốđộngvậtcóvúnhưlợn,ngựa,chó,mèo,hảicẩu,… vàcả conngười[32].ViruscúmAlàloạicóđộclựcmạnhnhất,cókhả năngbiếnđổigenrấtlớnvànguyênnhânchủ yếugâyracácvụđạidịchcúmtrongthếkỷqua.Dựavàosựkhácbiệtvề đặctínhkhángnguyêncủahaigly ...