Nghiên cứu một số yếu tố ảnh hưởng đến phản ứng PCR phát hiện nhanh vi khuẩn salmonella spp. gây ngộ độc thực phẩm

Trong nghiên cứu này, chúng tôi nghiên cứu một số yếu tố ảnh hưởng đến phản ứng PCR (Polymerase Chain Reaction) nhằm phát hiện nhanh Salmonella spp. so với các kỹ thuật sinh hóa truyền thống. Bộ genome của Salmonell spp. được thu nhận từ phương pháp dung dịch tách chiết (I, II, III, IV). Trình tự gen độc tố (enterotoxin) được khuếch đại bằng kỹ thuật PCR với các cặp mồi đặc hiệu khác nhau như UNI_O, UNI_I, InvA_fr, InvA_12.
Nội dung trích xuất từ tài liệu:
Nghiên cứu một số yếu tố ảnh hưởng đến phản ứng PCR phát hiện nhanh vi khuẩn salmonella spp. gây ngộ độc thực phẩmNGHIÊN CỨU MỘT SỐ YẾU TỐ ẢNH HƯỞNG ĐẾN PHẢN ỨNG PCR PHÁT HIỆNNHANH VI KHUẨN SALMONELLA SPP. GÂY NGỘ ĐỘC THỰC PHẨMTrần Hoàng Ngâu, Nguyễn Bá Thọ, Phạm Văn QuanTrường Đại học Công nghiệp Thực phẩm TP.HCMNgày gửi bài: 09/5/2016Ngày chấp nhận đăng: 30/5/2016TÓM TẮTSalmonella spp. là vi khuẩn có khả năng nhiễm vào bất cứ công đoạn nào của quá trình chế biến và bảoquản thực phẩm, nhất là thực phẩm tươi sống. Trong nghiên cứu này, chúng tôi nghiên cứu một số yếu tố ảnhhưởng đến phản ứng PCR (Polymerase Chain Reaction) nhằm phát hiện nhanh Salmonella spp. so với các kỹthuật sinh hóa truyền thống. Bộ genome của Salmonell spp. được thu nhận từ phương pháp dung dịch tách chiết(I, II, III, IV). Trình tự gen độc tố (enterotoxin) được khuếch đại bằng kỹ thuật PCR với các cặp mồi đặc hiệukhác nhau như UNI_O, UNI_I, InvA_fr, InvA_12. Nồng độ tối ưu của thành phần tham gia trong phản ứng PCRlà dNTPs và enzyme Taq Polymerase đều là 0.1mM để cho band DNA rõ nhất. Kết quả này giúp hoàn thiệnbước đầu việc nghiên cứu sản xuất bộ kit PCR thương mại phát hiện nhanh Salmonella spp. trong khoảng thờigian 3-5 giờ có ý nghĩa trong an toàn thực phẩm.Từ khóa: Gen độc tố, Salmonella spp., InvA gene, bộ kit PCRSTUDY OF INFLUENTIAL ELEMENTS IN POLYMERASE CHAIN REACTION (PCR) TODIAGNOGIS SALMONELLA SPP. FROM FOODING POISONINGABSTRACTSalmonella spp. bacteria is able to infect at any stage of processing and preserving food, especially freshfood. In this study, we invesgated influential elements in PCR test in order to identify fast Salmonella spp.compared to traditionally biochemistry techniques. Salmonella genome is extracted from isolation chemicalcompounds set (I, II, III, IV). Enterotoxin genes isolated from its are amplified by PCR technique with manydifferently specifical primers, such as: UNI_O, UNI_I, InvA_fr, InvA_12. Optimal concentration of dNTPs andTaq Polymerase is 0.1mM to discover clear and bright DNA bands. This study helping to produce PCR kitsmarket is important to diagnosis poising bacteria from food safety.Key words: Enterotoxin gene, Salmonella spp., InvA gene, PCR kit1. Đặt vấn đềDựa theo Tiêu chuẩn Việt Nam (TCVN 7926 – 2008) vi sinh vật trong thực phẩm yêucầu lượng Salmonella trong 25g là 0. Vì vậy, hiện nay có nhiều phương pháp được sử dụng đểphát hiện nhóm vi khuẩn này. Các phương pháp để phân tích Salmonella trong thực phẩm đaphần là sử dụng các phản ứng sinh hóa và ELISA nhưng các phương pháp này tốn thời gian từ5-7 ngày và rất tốn kém tiền bạc. Do đó, nhu cầu sử dụng các phương pháp phát hiệnSalmonella nhanh, nhạy và chính xác rất caoHiện nay những tiến bộ của sinh học phân tử đã được áp dụng nhiều trong các lĩnh vựcnghiên cứu khoa học. Kỹ thuật PCR (Polymerase Chain Reaction) là một trong những tiến bộcó thể phát hiện các dòng vi khuẩn thông qua việc khuyếch đại các đoạn DNA bằng các cặpmồi đặc hiệu. PCR có thể phát hiện ra một lượng nhỏ DNA bị trộn lẫn trong hỗn hợp cácDNA khác nhau. Nhiều kỹ thuật PCR đã được sử dụng để phát hiện Salmonella như PCR đơnmồi hoặc đa mồi. Với mục đích sản xuất thương mại hóa bộ kit PCR để phát hiện nhanhSalmonella spp. trong thực phẩm tại cơ sở, chúng tôi tiến hành nghiên cứu và tối ưu hóa cácthành phần tham gia trong phản ứng PCR đơn mồi với lần lượt các cặp mồi UNI và InvA.Mục tiêu của nghiên cứu này là khảo sát một số cặp mồi đặc hiệu và xác định nồng độ tốiứu của dNTPs, Taq Polymerase nhằm xây dựng quy trình PCR phát hiện Salmonella spp.Trong bài báo, chúng tôi trình bày kết quả nghiên cứu quy trình tách chiết tối ưu thu nhận34DNA genome của Salmonella spp. trong mẫu thực phẩm, kỹ thuật PCR đơn mồi với các cặpmồi đặc hiệu khác nhau phát hiện trình tự gen độc tố (enterotoxin) và nồng độ tối ưu của 2yếu tố ảnh hưởng đến PCR là dNTPs, Taq Polymerase.2. Vật liệu và phương pháp nghiên cứu2.1. Vật liệuNghiên cứu sử dụng vi khuẩn Salmonella spp. phân lập trong mẫu thực phẩm tự nhiên vàcung cấp từ Viện Pasteur Tp. Hồ Chí Minh và Viện Công nghệ Sinh học Hà Nội.2.2. Phương pháp nghiên cứu2.2.1. Khảo sát phân lập và định danh Salmonella spp. từ các nguồn thực phẩm tự nhiênMẫu thu nhận gồm lòng đỏ và trắng của trứng vịt (DT), vỏ trứng vịt (VT), thịt gà (TG),cà chua (CC), thịt heo (TH), sò (S1), sữa (S2), tôm (T), ruột gà (RG), thịt bò (TB). Mẫu đượctăng sinh trên môi trường BHI, sau đó cấy ria lên môi trường XLD, ủ ở 370C trong 18-24h.Quan sát khuẩn lạc tròn, màu hồng, trong suốt, có tâm đen. Tiến hành các thử nghiệm địnhdanh bằng các phản ứng sinh hóa như nhuộm Gram, H2S, LDC, Urea, Sorbitol, Indol, VosgesProskauer (VP). (Trần Hoàng Ngâu, 2015).2.2.2. Khảo sát phương pháp tách chiết DNA genome tối ưu của Salmonella spp.Thí nghiệm được khảo sát trên các mẫu Salmonella spp. dương tính. Chọn lọc 3 phươngpháp để khảo sát quy trình tách chiết và thu nhận DNA genome tối ưu là: đệm TE và nhiệt độ,Phenol: Chloroform: Isoamyl Alcohol (25:24:1), bằng dung dịch tách chiết (I, II, III, IV)(Trần Hoàng Ngâu, 2015).2.2.3. Khảo sát phương pháp PCR với các cặp mồi đặc hiệu khác nhauTổng thể tích của phản ứng PCR là 50µl. Các thao tác đều thực hiện trên đá. Chu kỳ phảnứng PCR gồm: (1) biến tính 950C, 5 phút; (2) bắt cặp, 720C, 30 giây; (3) kéo dài 720C, 1 phút,35 chu kỳ. Tiến hành khuếch đại trình tự DNA thu nhận bằng phản ứng PCR với các cặp mồiđặc hiệu có trình tự nucleotide là:Bảng 2.1: Trình tự các cặp mồi đặc hiệuKý hiệuKích thước sản phẩmTrình tự mồi (5’-3’)mồiPCR (bp)GTGTAGCGGTGAAATGCGUNI_O709bpACGGGCGGTGTGTACAAGGTGGAGCATGTGGTTTAUNI_I287bpCCATTGTAGCACGTGTGTGTGAAATTATCGCCACGTTCGGGCAAInvA_12284bpTCATCGCACCGTCAAAGGAACCTGGCATTATCGATCAGTACCAGInvA_fr600bpAACAGCTGCGTCATGATATTCC2.2.4. Khảo sát sự ảnh hưởng của nồng độ dNTPs và Taq Polymerase đến phản ứng PCRTiến hành khảo sát sự biến thiên của nồng độ khác nhau d ...