Quy trình định týp gen caga và vaca của helicobacter pylori bằng phương pháp multiplex polymerase chain reaction

Nghiên cứu trình bày về xây dựng quy trình phát hiện và định týp gen cagA và vacA của vi khuẩn helicobacter pylori (H. pylori) trong bệnh phẩm dựa trên kỹ thuật multiplex PCR. Quy trình được xây dựng bao gồm các bước kiểm tra mẫu, phát triển phương pháp tách chiết DNA, tối ưu hóa phản ứng multiplex PCR và xác định độ nhạy của phản ứng. Tiếp theo, quy trình được kiểm tra trên một số mẫu sinh thiết dạ dày của bệnh nhân ung thư và viêm dạ dày.
Nội dung trích xuất từ tài liệu:
Quy trình định týp gen caga và vaca của helicobacter pylori bằng phương pháp multiplex polymerase chain reactionQUY TRÌNH ĐỊNH TÝP GEN CagA VÀ VacA CỦA Helicobacter pylori BẰNG PHƯƠNGPHÁP MULTIPLEX POLYMERASE CHAIN REACTIONHồ Huỳnh Thùy Dương, Nguyễn Tuấn Anh, Trần Thiện TrungĐịa chỉ liên lạc: PGS TS BS Trần Thiện Trung, Bộ môn Ngoại, Đại học Y Dược TP. Hồ Chí Minh, ñiện thoại:0903645659, Email: tranthientrung @ yahoo.comTÓM TẮTChúng tôi xây dựng quy trình phát hiện và ñịnh týp gen cagA và vacA của vi khuẩn Helicobacter pylori (H. pylori)trong bệnh phẩm dựa trên kỹ thuật multiplex PCR. Quy trình ñược xây dựng bao gồm các bước kiểm tra mẫu, pháttriển phương pháp tách chiết DNA, tối ưu hóa phản ứng multiplex PCR và xác ñịnh ñộ nhạy của phản ứng. Tiếptheo, quy trình ñược kiểm tra trên một số mẫu sinh thiết dạ dày của bệnh nhân ung thư và viêm dạ dày. Kết quảcho thấy quy trình có khả năng phát hiện và ñịnh týp chính xác gen cagA và vacA của vi khuẩn H. pylori một cáchnhanh chóng và ñơn giản. Quy trình ñã ñược xây dựng thành công, có khả năng phát triển thành một phương phápchẩn ñoán nhanh, chính xác và có thể ñược sử dụng như một công cụ nghiên cứu dịch tễ học sự nhiễm H. pylori,và tìm hiểu mối liên quan giữa các týp gene cagA và vacA với các biểu hiện lâm sàng ở bệnh nhân ung thư vàviêm dạ dày.ABSTRACTPROTOCOL FOR THE DETECTION OF VACA GENOTYPES AND CAGA GENE OFHELICOBACTER PYLORI FROM GASTRIC BIOPSIES BY A NOVEL MULTIPLEXPOLYMERASE CHAIN REACTION ASSAYWe set up a multiplex PCR-based protocol for the detection and genotyping of cagA and vacA genes. Theprotocol includes clinical samples selection, DNA extraction, multiplex PCR optimization and sensitivitydetermination. The set up protocol was then applied to some gastric cancer and gastritis biopsies. We showed thatthis can be a rapid and simple method to detect and genotype H. pylori in clinical samples. The multiplex PCRprotocol can be developed into a rapid and accurate diagnostic kit as well as a tool to study H. pylori infectionepidemiology and the relationship between cagA and vacA genotypes with clinical manifestations in patients.ĐẶT VẤN ĐỀHelicobacter pylori (H. pylori), xoắn khuẩn Gram âm có trong dạ dày người, ñược chứng minh là có liên quanñến các bệnh về dạ dày-tá tràng và ung thư dạ dày (7). Các chủng H. pylori khác nhau có thể có ñộc tính khác nhautrong quá trình gây bệnh trên người (2).Nhiều gen của H. pylori ñược chọn ñể phát hiện sự hiện diện của vi khuẩn này trong bệnh phẩm (urease,rRNA 16S, gen bám-adhesion gene…). Trong nghiên cứu này, chúng tôi quan tâm ñến hai gen cagA (cytotoxinassociated gene) và vacA (vacuolating toxin gene) vì sản phẩm của chúng ñược coi là hai yếu tố ñộc lực chủ yếucó khả năng gây bệnh và ñặc trưng của vi khuẩn H. pylori (1, 4). Sự kết hợp các týp gen khác nhau giữa hai gen nàycó thể liên quan ñến biểu hiện lâm sàng khác nhau ở người bệnh. Gen cagA có thể không có ở tất cả các chủng H.pyori. Sự hiện diện của gen cagA ở một chủng nào ñó thường có liên quan ñến những hậu quả lâm sàng nghiêmtrọng cho người bị nhiễm (3). Protein cagA, có kích thước từ 128 ñến 140 kDa, có khả năng kích thích phản ứngphosphoryl hóa tyrosine trong tế bào ký chủ, dẫn ñến sự tăng sinh bất thường của các tế bào biểu mô dạ dày (9).Trong khi ñó, gen vacA có mặt ở tất cả các chủng H. pylori, cảm ứng hình thành không bào. Cấu trúc gen này chứaít nhất hai vùng biến ñổi gồm vùng “tín hiệu” và vùng “giữa”. Vùng “tín hiệu” có thể có các týp gen là s1 hoặc s2.Vùng giữa có thể có các týp gen là m1 hoặc m2. Độc lực cao hay thấp của gen vacA phụ thuộc vào các týp gen của185hai vùng này. Chủng H. pylori với týp gen s1/m1 tạo ra ñộc tố mạnh hơn và có khả năng gây bệnh cao hơn cácchủng khác, trong khi ñó chủng H. pylori với týp gen s2/m2 tạo ra ít hoặc không tạo ra ñộc tố (1).Việc phát hiện và phân týp H. pylori có thể ñược thực hiện bằng nhiều phương pháp như giải trình tự,PCR và lai phân tử với mẫu dò ñặc hiệu. Trong ñó, phương pháp PCR có nhiều ưu ñiểm như ñộ nhạy cao, thao tácnhanh, chi phí thấp. Phương pháp PCR ñã ñược sử dụng thành công ñể phát hiện và phân týp cagA và vacA trựctiếp từ mẫu sinh thiết dạ dày và còn ñược dùng ñể phát hiện H. pylori từ nhiều nguồn mẫu khác nhau như dịch dạdày, nước bọt, mảng cao răng và phân người (10). Ngoài ra, việc áp dụng kỹ thuật multiplex PCR còn cho phép pháthiện và ñịnh týp ñồng thời các gen vacA và cagA chỉ trong một phản ứng.Nghiên cứu này nhằm xây dựng qui trình multiplex PCR ñể ñịnh týp gen cagA và vacA của H. pylori từmẫu sinh thiết dạ dày của bệnh nhân viêm và ung thư dạ dày có H. pylori-dương tính. Từ ñó phát triển một phươngpháp chẩn ñoán nhanh và chính xác nhiễm H. pylori, ñồng thời cung cấp một công cụ nghiên cứu dịch tễ họcnhiễm H. pylori, và một phương pháp ñể tìm hiểu mối liên quan giữa các týp gene cagA và vacA với các biểu hiệnlâm sàng ở bệnh nhân ung thư và viêm dạ dày.ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨ ...