Tối ưu thông số lên men sinh tổng hợp α-L-rhamnosidase bởi Aspergillus niger ĐH51 sử dụng phương pháp đáp ứng bề mặt

Nghiên cứu này trình bày việc sử dụng thiết kế tối ưu đa yếu tố theo Plackett - Burman nhằm sàng lọc các yếu tố ảnh hưởng [3, 4] tới khả năng sinh tổng hợp Rha bởi A. niger ĐH51. Sau bước sàng lọc ban đầu, phương pháp đáp ứng bề mặt theo mô hình Box - Behnken được thực hiện để xác định giá trị tối ưu.
Nội dung trích xuất từ tài liệu:
Tối ưu thông số lên men sinh tổng hợp α-L-rhamnosidase bởi Aspergillus niger ĐH51 sử dụng phương pháp đáp ứng bề mặt Nghiên cứu khoa học công nghệ TỐI ƯU THÔNG SỐ LÊN MEN SINH TỔNG HỢP α-L-RHAMNOSIDASE BỞI Aspergillus niger ĐH51 SỬ DỤNG PHƯƠNG PHÁP ĐÁP ỨNG BỀ MẶT ĐINH THỊ THU TRANG (1), NGUYỄN THU HOÀI (1), ĐỖ TẤT THỊNH (1), LÊ THỊ HUỆ (1), VŨ THỊ HẠNH NGUYÊN (2) 1. ĐẶT VẤN ĐỀ Enzyme α-L-rhamnosidase (EC 3.2.1.40) (Rha) xúc tác phân cắt đặc hiệu đầuα-L-rhamnose của nhiều hợp chất tự nhiên như naringin, rutin, quercitrin, hesperidinvà các glycoside khác chứa α-L-rhamnose [1]. Rha được sử dụng trong nhiều ngànhcông nghiệp, đặc biệt là công nghiệp thực phẩm. Trong số các loại nấm, Aspergillusniger được coi là nguồn vi sinh vật tiềm năng cho quá trình sinh tổng hợp enzymeRha không chỉ bởi khả năng sinh enzyme cao mà còn do được liệt kê trong danhmục vi sinh vật an toàn cho thực phẩm và dược phẩm [2]. Quá trình lên men chìmsản xuất Rha ngoại bào bị ảnh hưởng bởi nhiều yếu tố như thành phần môi trường,nồng độ các chất cảm ứng, pH ban đầu, ion kim loại, thời gian và nhiệt độ lên men.Vì vậy, để quá trình lên men được hiệu quả và ổn định, việc tối ưu hóa các điều kiệnlà cần thiết. Phương pháp tối ưu hóa truyền thống thực hiện với từng yếu tố, tuy đơngiản, dễ thực hiện nhưng tốn kém chi phí và thời gian do đòi hỏi bộ dữ liệu thửnghiệm lớn. Ngoài ra, do khảo sát đơn lẻ không phản ánh tương tác giữa các yếu tố,phương pháp tối ưu truyền thống thường có sự sai lệch lớn giữa thực nghiệm và môhình. Để khắc phục nhược điểm của phương pháp tối ưu truyền thống, trong nghiêncứu này chúng tôi sử dụng thiết kế tối ưu đa yếu tố theo Plackett - Burman nhằmsàng lọc các yếu tố ảnh hưởng [3, 4] tới khả năng sinh tổng hợp Rha bới A. nigerĐH51. Sau bước sàng lọc ban đầu, phương pháp đáp ứng bề mặt theo mô hình Box -Behnken được thực hiện để xác định giá trị tối ưu. 2. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU Chủng vi sinh vật và môi trường nuôi cấy Chủng A. niger ĐH51 sử dụng trong nghiên cứu được tiếp nhận từ bộ sưu tậpcủa Phân viện Công nghệ sinh học, Trung tâm Nhiệt đới Việt - Nga ở dạng ống đôngkhô. Sau khi hoạt hóa trên môi trường dinh dưỡng, bào tử nấm được thu hồi và nuôicấy trên môi trường sinh tổng hợp Rha (thành phần (g/L): KCl - 0,5; KH2PO4 - 15;NH4Cl - 4; yeast extract - 5; dung dịch Vishniac - 1 mL; MgSO4.7H2O 10 % (w/v) -5 mL; rhamnose - 1%; rutin 0,5%; pH 5,5 [5]) ở nhiệt độ 30oC, tốc độ lắc 250vòng/phút trong 7 ngày. Xác định hoạt độ enzyme Rha Hoạt độ enzyme được xác định dựa trên phương pháp của Romero và cs. [6]với một số cải tiến. Cụ thể, hút lần lượt 0,4 ml p-nitrophenyl-α-L-rhamnopyranoside80 Tạp chí Khoa học và Công nghệ nhiệt đới, Số 19, 11 - 2019Nghiên cứu khoa học công nghệ(pNPR) (Sigma) 3,5 mM; 0,5 ml đệm axetat 0,1 M; 0,1 ml dịch enzyme thô vào ốngnghiệm 5 ml. Ủ hỗn hợp này ở 50°C trong 10 phút. Sau đó bổ sung 3 ml NaOH 0,5M để dừng phản ứng. Mẫu đối chứng sử dụng là dịch enzyme thô được bất hoạt ở95°C trong 30 phút. Hỗn hợp phản ứng của mẫu thí nghiệm và đối chứng được đomật độ quang tại bước sóng 400 nm. Dựa vào đường chuẩn p-nitrophenolat tínhđược hoạt độ enzyme α-L-rhamnosidase trong dịch thô. Một đơn vị hoạt độ củaenzyme là lượng enzyme cần thiết để thủy phân cơ chất pNPR tạo thành 1 μmol p-nitrophenol trong một phút ở điều kiện thí nghiệm. Xác định và tối ưu hóa các yếu tố ảnh hưởng đến sinh tổng hợp Rha Hàm mục tiêu theo thiết kế Plackett-Burman được sử dụng để thực hiện 12 thínghiệm với sự thay đổi của 11 yếu tố bao gồm các điều kiện và thành phần môitrường nhằm xác định yếu tố ảnh hưởng tới sinh tổng hợp Rha [4]. Thiết kế Box-Behnken và phương pháp đáp ứng bề mặt được áp dụng để xây dựng các thí nghiệmxác định giá trị tối ưu cho các thông số lựa chọn [5]. Hàm đáp ứng được chọn hoạt tính enzyme Rha (U/ml): y = b0 + b1A + b2B+b3C + b12 AB + b23 BC + b13AC + b11A2 + b22B2 + b33C2. Trong đó, b1, b2, b3 là cácbậc hệ số 1; b11, b22, b33 là các bậc hệ số 2; b12, b23, b13 là các hệ số tương tác; A, B,C, AB, BC, AC là các biến độc lập (các yếu tố tối ưu). Số liệu được phân tích bằngphần mềm Design Expert 12.0.0.6 (Stat-Ease Inc., Minneapolis, USA). Ảnh hưởng tốc độ cấp khí Thí nghiệm trên thiết bị lên men 10 lít (chứa 5 lít môi trường) với với các tốcđộ cấp khí khác nhau (0,2; 0,4; 0,6; 0,7; 0,8; 1; 1,2 thể tích khí/thể tích môitrường/phút (vvm)). Các điều kiện lên men khác cố định theo thông số đã được tốiưu trên bình tam giác như môi trường thích hợp, tỷ lệ tiếp giống 5%; nhiệt độ lênmen 30oC; pH = 5,7; thời gian lên men 7 ngày. Ảnh hưởng của tốc độ khuấy Thí nghiệm trên thiết bị lên men 10 lít (chứa 5 lít môi trường) với các tốc độkhuấy khác nhau (50; 100; 150; 200; 250; 300 rpm) ở thể tích môi trường ban đầu là5 lít. Các điều kiện lên men khác được cố định như môi trường thích hợp; tỷ lệ tiếpgiống 5%; nhiệt độ lên men 30oC; độ sục khí ban đầu là 100% thể tích; tốc độ cấpkhí 0,8 vvm; pH bắt đầu lên men là 5,7. 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 3.1. Sàng lọc các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình sinh tổng hợp RhaNghiên cứu ảnh hưởng của các yếu tố về điều kiện và thành phần môi trường nuôicấy chủng nấm Aspergillus niger ĐH51 đến sinh tổng hợp enzyme Rha đã lựa chọn11 yếu tố với các giá trị khác nhau thể hiện trong bảng 1.Tạp chí Khoa học và Công nghệ nhiệt đới, Số 19, 11 - 2019 81 Nghiên cứu khoa học công nghệ Bảng 1. Mức độ ảnh hưởng cúa các yếu tố thiết kế trong ma trận Plackett-Burman Giá trị của các Mức độ ảnh hưởng Biến ...