Tinh sạch protein (tt)

Thu nhận protein mục tiêu dựa trên độ hoà tan, kích thước, điện tích, và liên kết ái lực Hàng ngàn protein đã được tinh sạch ở dạng có hoạt tính dựa trên những đặc tính căn bản như độ hòa tan, kích thước, điện tích và liên kết ái lực. Thông thường, một hỗn hợp protein sẽ trải qua nhiều giai đoạn phân tách, mỗi giai đoạn dựa trên một đặc tính nhất định, để cuối cùng là một protein tinh sạch. ...
Nội dung trích xuất từ tài liệu:
Tinh sạch protein (tt) Tinh sạch protein (tt)IV. Thu nhận protein mục tiêudựa trên độ hoà tan, kích thước,điện tích, và liên kết ái lựcHàng ngàn protein đã được tinh sạchở dạng có hoạt tính dựa trên nhữngđặc tính căn bản như độ hòa tan, kíchthước, điện tích và liên kết ái lực.Thông thường, một hỗn hợp proteinsẽ trải qua nhiều giai đoạn phân tách,mỗi giai đoạn dựa trên một đặc tínhnhất định, để cuối cùng là một proteintinh sạch. Ở mỗi bước phân tách, thửnghiệm xác định hoạt tính và xác địnhnồng độ protein đều được thực hiện.Lượng đáng kể protein tinh sạch,khoảng vài miligram, có thể giúp tabiết được cấu trúc không gian bachiều và cơ chế phản ứng của nó. Vìvậy, sản lượng toàn phần là một điểmquan trọng của quá trình tinh sạch.Các kỹ thuật tinh sạch thường dùng:tủa bằng muối, màng bán dẫn, sắc ký. IV.1 Tủa bằng muốiỞ nồng độ muối cao, phần lớn proteinsẽ giảm tính hòa tan, hiện tượng nàygọi là tủa bằng muối (salting out).Mỗi loại protein sẽ kết tủa ở một nồngđộ muối nhất định. Vì vậy, hiện tượngtủa bởi muối có thể được dùng đểphân đoạn protein. Ví dụ nhưfibrinogen tủa ở nồng độ muốiammonium sulfate 0.8 M trong khiphải đến nồng độ 2.4 M, albumin mớikết tủa. Hiện tượng này được sử dụngđể tăng nồng độ của một dung dịchprotein loãng chứa các phân đoạn cóhoạt tính của các bước tinh sạchtrước. Nếu cần thiết, lượng muối cóthể được loại bỏ bằng sự thẩm tách IV.2 Sự thẩm táchProtein có thể được phân tách bằng sựthẩm tách thông qua màng bán dẫn,chẳng hạn màng cellulose với nhiềulỗ. Những phân tử có cấu trức khônggian nhất định lớn hơn dường kínhcủa lỗ sẽ bị giữ lại bên trong túi thẩmtách, trong khi đó, những phân tử nhỏhơn và các ion sẽ đi qua các lỗ đó rangoài túi. Kỹ thuật này dùng để loạibỏ muối hay tách những phân tử nhỏ,nhưng với kỹ thuật này không phânbiệt được các loại protein với nhau. IV.3 Sắc kýSắc ký là một phương pháp phân táchquan trọng nhất trong sinh học phântử vì nó thích hợp với nhiều loại hợpchất và sản phẩm tinh sạch có thểđược sử dụng ngay cho việc địnhlượng và định danh.Một hệ sắc ký gồm pha tĩnh, pha độngvà mẫu cần phân tách. Trong đó, tùyvào loại mẫu cần phân tách ta có thểlựa chọn loại sắc ký cũng như nguyênliệu cho pha cố định và pha di động.Trong tinh sạch protein, có bốnphương pháp được ứng dụng nhiềunhất là sắc ký lọc gel dựa vào kíchthước của phân tử (size exclusionchromagraphy), sắc ký trao đổi iondựa vào điện tích của phân tử (ionexchange chromagraphy), sắc ký áilực dựa vào ái lực của phân tử vớimột loại phân tử khác (affinitychromagraphy) và sắc ký lỏng cao ápdựa vào kích thước của phân tử nhưngcó độ phân giải cao nhờ vào áp suất(high pressure liquid chromagraphy). IV.3.1 Sắc ký lọc gelPhương pháp này tốt hơn các phươngpháp trên vì nó dựa vào kích thướcphân tử. Mẫu sẽ được nạp vào đầumột cột chứa nhiều hạt có lỗ làm từpolymer không tan nhưng có tínhhydrate hóa cao như dextran, agarose(những dạng cabohydrate) haypolyacrylamide. Sephadex,Sepharose, và Bio-gel là những loạigel phổ biến trên thị trường có sẵnnhững hạt có lỗ với đường kính chuẩnlà 100µm (0.1mm). Những phân tửnhỏ có thể ở cả bên trong lẫn giữa cáchạt, trong khi đó những phân tử lớnhơn chỉ có thể ở bên ngoài các hạt. Vìvậy, những phân tử có kích thước lớntrong cột sẽ chảy nhanh hơn và rangoài trước . Phân tử có kích thướctrung bình, có thể thỉnh thoảng vàođược bên trong hạt sẽ rời khỏi cột ở vịtrí giữa; còn những phân tử nhỏ sẽphải đi qua đoạn đường dài hơn,quanh co nên sẽ ra sau cùng. IV.3.2 Sắc ký trao đổi ionTại bất kỳ một điểm pH nào trừ điểmđẳng điện, các protein đều có mangmột điện tích tương ứng với điểm pHđó. Dựa vào điện tích thực của chúngtại một điểm pH nhất định, ta có thểphân tách hỗn hợp protein. Phươngpháp này gọi là phương pháp sắc kýtrao đổi ion. Trong phương pháp này,pha tĩnh là những hạt mang sẵn mộtđiện tích nhất định, những hạt này sẽtương tác với các phân tử (protein)mang điện tích trái dấu với chúng. Cụthể, nếu hạt mang điện âm (như cộtcarboxymethyl-cellulose (CM-cellulose)), tiến trình được gọi là sắcký trao đổi ion dương, thì sẽ tương tácvới những phân tử mang điện tíchdương. Ngược lại, nếu hạt mang điệntích dương (như cộtdiethylaminoethyl-cellulose (DEAE-cellulose)), gọi là sắc ký trao đổi ionâm, thì tương tác với phân tử mangđiện tích âm. Vì thế, những proteincùng dấu với cột sẽ chạy ra khỏi cộttrong khi những protein trái dấu bị giữlại cột. Để phóng thích những proteinnày, ta tăng nồng độ ion của phađộng, những ion này sẽ thế phân tửprotein tương tác với các hạt mangđiện tích. Ví dụ, trong sắc ký trao đổiion dương, ta thêm muối natri cloruahay muối khác trong dung dịch táchgiải bởi vì ion natri sẽ tranh bám vàocột với các protein có điện tích dương,do đó, những protein mang điện tíchdương được phóng thích ra ngoài cộtlần lượt theo độ lớn về điện tích.Hình 1: minh họa sắc ký trao đổi ion Hình 2: minh họa cơ chế giữa protein trong hệ sắc ký trao đổi ion(a) Những hạt mang điện tích dươngsẽ trao đổi ion âm với dung dịchđệm. Protein tích điện âm cũng iondương tương tác với nó(b) Khi protein gắn với hạt, proteinthay thế những ion âm tương tác vớihạt cũng như hạt thay thế những iondương tương tác với protein IV.3.3 Sắc ký ái lựcĐây là một phương pháp rất hiệu quảvà được ứng dụng rộng rãi trong việctinh sạch protein. Kỹ thuật này dựatrên ái lực cao của nhiều protein vớinhững nhóm hóa học chuyên biệt. Vídụ, concanavalin A, một loại proteinthực vật, có thể được tinh sạch khicho qua cột mang những phân tửglucose bằng liên kết cộng hóa trị.Concanavalin A gắn vào cột bởi vì nócó ái lực cao với glucose, trong khi đónhững protein khác thì không.Concanavalin A có thể được tách giảikhỏi cột khi ta cho thêm dung dịchglucose đậm đặc vào. Phân tử đườngtrong dung dịch sẽ gắn vớiConcanavalin A thay thế những phântử glucose n ...