So sánh hiệu quả của hai chỉ thị issr và rapd trong nghiên cứu đa dạng di truyền loài cọ khẹt (Dalbergia assamica)

Nghiên cứu này đề cập đến việc so sánh hiệu quả của hai chỉ thị ISSR và RAPD trong nghiên cứu đa dạng di truyền nhằm bảo tồn loài D. assamica ở Việt Nam. Mời các bạn tham khảo!
Nội dung trích xuất từ tài liệu:
So sánh hiệu quả của hai chỉ thị issr và rapd trong nghiên cứu đa dạng di truyền loài cọ khẹt (Dalbergia assamica)HỘI NGHỊ KHOA HỌC TOÀN QUỐC VỀ SINH THÁI VÀ TÀI NGUYÊN SINH VẬT LẦN THỨ 4SO SÁNH HIỆU QUẢ CỦA HAI CHỈ THỊ ISSR VÀ RAPD TRONGNGHIÊN C ỨU ĐA DẠNG DI TRUYỀN LOÀI CỌ KHẸT (DALBERGIA ASSAMICA)VŨ THỊ THU HIỂN, ĐINH THỊ PHÒNG, TRẦN THỊ VIỆT THANHBảo tàng Thiên nhiên Việt NamCọ khẹt có tên khoa học Dalbergia assamica, là loài cây gỗ quý có giá trị kinh tế cao ở ViệtNam. Cọ khẹt được tìm thấy ở Campuchia, Mianma, Lào, Thái Lan, Trung Quốc, Ấn Độ vàViệt Nam. Ở Việt Nam loài này mọc ở khắp các tỉnh miền Bắc, miền Trung và Tây Nguyên. Docó giá trị sử dụng cao nên chúng đang bị săn lùng khai thác quá mức.Trong những năm gần đây, kỹ thuật sinh học phân tử đang được áp dụng rộng rãi, có hiệuquả trong nghiên cứu đa dạng di truyền quần thể. Các chỉ thị AFLP, ISSR, RAPD, cpSSR...được sử dụng đánh giá đa dạng di truyền, trong đó 2 chỉ thị thị ISSR và RAPD hay được lựachọn vì tương đối đơn giản, dễ thực hiện mà lại hiệu quả. Đến nay ngày càng có nhiều côngtrình công bố về nghiên cứu đa dạng di truyền quần thể ở mức độ phân tử, đây là nguồn tư liệucần thiết, hữu ích giúp cho công tác bảo tồn tài nguyên sinh vật trên toàn cầu. Nghiên cứu nàyđề cập đến việc so sánh hiệu quả của hai chỉ thị ISSR và RAPD trong nghiên cứu đa dạng ditruyền nhằm bảo tồn loài D. assamica ở Việt Nam.I. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨUMẫu lá được thu từ 35 cây Cọ khẹt (D. assamica) do Phòng Sinh học - Bảo tàng Thiênnhiên Việt Nam cung cấp có ký hiệu và nơi thu thập như Bảng 1.Bảng 1Nguồn gốc và ký hiệu của 35 mẫu cây gỗ Cọ khẹt dùng trong nghiên cứuTT1.2.3.4.5.6.7.8.9.10.11.12.13.14.15.16.17.18.MẫuDa1Da2Da3Da4Da5Da6Da7Da8Da9Da10Da11Da12Da13Da14Da15Da16Da17Da18Nguồn gốcVQG Cúc PhươngHà NộiHà NộiHà NộiHà NộiVQG Cúc PhươngVQG Cúc PhươngVQG Cúc PhươngVQG Cúc PhươngVQG Cúc PhươngVQG Cúc PhươngVQG Cúc PhươngVQG Cúc PhươngVQG Cúc PhươngVQG Cúc PhươngVQG Cúc PhươngVQG Cúc PhươngVQG Cúc PhươngTT19.20.21.22.23.24.25.26.27.28.29.30.31.32.33.34.35.MẫuDa19Da20Da21Da22Da23Da24Da25Da26Da28Da28Da29Da30Da31Da32Da33Da34Da35Nguồn gốcVQG Cúc PhươngVQG Cúc PhươngVQG Cúc PhươngVQG Cúc PhươngVQG Cúc PhươngVQG Cúc PhươngVQG Cúc PhươngVQG Cúc PhươngVQG Cúc PhươngVQG Cúc PhươngVQG Cúc PhươngVQG Cúc PhươngVQG Cúc PhươngVQG Cúc PhươngVQG Cúc PhươngVQG Cúc PhươngVQG Cúc PhươngCác mồi sử dụng trong nghiên cứu là 25 mồi cho chỉ thị ISSR và 25 mồi cho chỉ thị RAPD.591HỘI NGHỊ KHOA HỌC TOÀN QUỐC VỀ SINH THÁI VÀ TÀI NGUYÊN SINH VẬT LẦN THỨ 4Bảng 2Trình tự các nucleotide của 50 chỉ thị ISSR và RAPD được sử dụng trong nghiên cứuTT1.2.3.4.5.6.7.8.9.10.11.12.13.14.15.16.17.18.19.20.21.22.23.24.25.Trình tựNucleotideChị thị ISSRIS1(CAG)5IS2(CAA)5IS3(GACA)4IS5(CCG)6IS6(CTC)6IS7(GGC)6IS9(TG)8GAIS10(CTC)8IS11(CCA)5IS12(CCCT)4IS13(GT)8CIS14(CTCT)4GTCIS15(CA)8AIS17(CT)8TP46(AG)8TP49(GA)8TP51(GA)8AP52(CT)8GP55(AC)8TP56(AC)8GP61(AC)8TGP63CTC(GA)7P64ACA(GT)7P67(ATG)6P69(GGGTG)3Tên mồiTT1.2.3.4.5.6.7.8.9.10.11.12.13.14.15.16.17.18.19.20.21.22.23.24.25.Tên mồiOPC19OPP08OPP19OPN05OPC05OPR15OPN16OPG13OPD13OPE20OPD20OPA02OPH03OPD03UBC348OPA15OPE14OPW13OPB05OPH04OPP15OPB12OPV06OPR08OPN11Trình tự NucleotideChỉ thị RAPDGTTGCCAGCCACATCGCCCAGGGAAGGACAGATGACCGCCGGACAACGAGAAGCGACCTGCTCTCCGCCAGGGGTGACGAAACGGTGACCACCCGGTCACAGACGTCCACTGCCGAGCTGGTCGCCGTCACACGGCTGCGTTCCGAACCCTGCGGCTGAGTGCGCCCTTCGTGAGGCGTCGGAAGTCGCCGGAAGTCGCCGGAAGCCAACCCTTGACGCACCTTGACGCACTGCTGGGACTGTAGCTGGGTách DNA tổng số từ mẫu lá theo phương pháp CTAB [3]. Trình tự các nucleotide của 50chỉ thị ISSR và RAPD đã sử dụng trong nghiên cứu được trình bày trong Bảng 2. Kỹ thuật PCR- ISSR thực hiện theo chu trình nhiệt: 94ºC trong 4 phút; 35 chu kỳ: 94ºC trong 1 phút, 40 45ºC trong 30 giây, 72ºC trong 1 phút; 72ºC trong 10 phút; giữ hỗn hợp PCR ở 4ºC. Chu trìnhnhiệt phản ứng PCR - RAPD: 94ºC trong 1 phút; 45 chu ỳ:k 92ºC trong 1 phút, 35ºC trong 1phút, 72ºC trong 1 phút; 72ºC trong 10 phút; giữ hỗn hợp PCR ở 4ºC. Điện di sản phẩm PCR trêngel agarose 1,5%, nhu ộm Ethidium bromide và chụp ảnh trên máy soi gel.Phân tích số liệu: theo quy ước cho điểm 1 khi có phân đoạn DNA xuất hiện và 0 khi khôngcó phân đoạn DNA tương đồng xuất hiện trong bản điện di sản phẩm ISSR, RAPD với các mồi.Xác định hệ số di truyền giống nhau, giá trị PIC, lập biểu đồ hình cây để so sánh hệ số tươngđồng di truyền giữa 35 mẫu cọ khẹt theo phương pháp Nei và Li [11]. Số liệu được xử lý bằngchương trình NTSYSpc version 2.0.II. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU1. Đa dạng di truyền DNA của 35 mẫu Dabergia assamica với chỉ thị ISSRNhân bản các đoạn DNA bằng kỹ thuật PCR-ISSR sử dụng 25 mồi với 35 mẫu D. assamicacho kết quả: Trong tổng số 25 mồi ISSR thì có 22/25 mồi tạo ra sự đa hình DNA với giá trị PIC592HỘI NGHỊ KHOA HỌC TOÀN QUỐC VỀ SINH THÁI VÀ TÀI NGUYÊN SINH VẬT LẦN THỨ 4dao động từ 0 (IS5, IS13 và P63) đến 0,423 (IS9). Tổng số phân đoạn DNA khi phân tích với 25chỉ thị ISSR là 102, trong đó có 65 phân đoạn là đa hình (chiếm 63,73%) và 37 phân đoạn đồnghình (chiếm 36,27%) (Bảng 3). Số lượng các phân đoạn DNA nhân bản với các mồi biến độngtừ 1 (IS13) đến 8 (IS3, P49 và P64) phân đoạn và đa dạng về kích thước từ khoảng 200 bp đến2000 bp. Hình 1 trình bàyđại diện kết quả điện di sản phẩm PCR - ISSR của 35 mẫuD. assamica với mồi IS15. Trong số 06 phân đoạn DNA được nhân bản thì có 06 phân đoạn đahình (chiếm 100%). Các phân đoạn có kích thước khoảng từ 0,3 kb đến 1,1 kb. Tính đa hìnhDNA của các mẫu được thể hiện tương đối rõ. Ví dụ ở vị trí khoảng 0,6 kb (mũi tên: →), chỉ códuy nhất mẫu Da8 (giếng 8) không xuất hiện phân đoạn DNA, 34 mẫu còn lại đều xuất hiệnphân đoạn DNA. Hay tại vị trí 0,65 kb (mũi tên ...